第四章 生物化学-核酸化学

第四章核酸化学4.6

核酸的分离、合成和鉴定4.1概述4.2核苷酸4.3核酸的结构4.4核酸的性质4.5

核酸的生物学功能4.1概述1.核酸（nucleicacid）的发现1869年，F.Miescher从细胞核中分离出核素。A.Kossel发现核素是蛋白质和核酸的复合物，并分析出核酸的组成及各组成成分的比例。核酸核苷酸磷酸核苷戊糖碱基水解

2.核酸的组成和分类核酸分为：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）—主要集中在细胞核，线粒体和叶绿体中也有少量DNA；核糖核酸（ribonucleicacid，RNA）—90%分布在细胞质中，10％存在于细胞核中。3.核酸的重要性

核酸是遗传的物质基础1928:Griffith1928年，英國軍醫FrederickGriffith(1881~1941)以老鼠實驗發現，將活的良性肺炎雙球菌與死的惡性肺炎雙球菌混合，可以引起轉型，得到活的惡性菌，使老鼠死亡。

OswaldAvery(1877-1955)

MicrobiologistAveryledtheteamthatshowedthatDNAistheunitofinheritance.OneNobellaureatehascalledthediscovery"thehistoricalplatformofmodernDNAresearch",andhisworkinspiredWatsonandCricktoseekDNA'sstructure.1944年完成的肺炎球菌转化试验，证明DNA携带遗传信息。4.2核苷酸(nucleotide)

4.2.1核苷酸的结构1.戊糖

RNA中含D-核糖(ribose)DNA中含D-2-脱氧核糖(deoxyribose)2.碱基(base)包括嘧啶碱和嘌呤碱两类稀有碱基（minorbase）假尿嘧啶核苷次黄嘌呤核苷二氢尿嘧啶核苷甲基鸟嘌呤核苷3.核苷（nucleoside）戊糖和碱基缩合而成的糖苷称为核苷。N9N1β1’β1’腺嘌呤核苷（adenosine，A）胞嘧啶脱氧核苷（deoxycytidine，dC）戊糖C1和嘧啶碱N1相连接戊糖C1和嘌呤碱N9相连接RNA中主要的核糖核苷DNA中主要的脱氧核糖核苷腺嘌呤核苷（adenosine，A）腺嘌呤脱氧核苷（deoxyadenosine，dA）鸟嘌呤核苷（guanosine，G）鸟嘌呤脱氧核苷（deoxyguanosine，dG）胞嘧啶核苷（cytidine，C）胞嘧啶脱氧核苷（deoxycytidine，dC）尿嘧啶核苷（uridine，U）胸腺嘧啶脱氧核苷（deoxythymidine，dT）核糖核苷和脱氧核糖核苷核苷常用单字母符号表示：如腺苷用A表示，脱氧核苷在符号前加小写字母d，如脱氧腺苷用dA表示。稀有核苷（修饰核苷）修饰碱基与核糖或脱氧核糖连接5，6-二氢尿苷正常碱基与修饰核糖连接2`-O-甲基腺苷碱基和核糖以特殊方式连接假尿嘧啶核苷C54.核苷酸（nucleotide）核苷中戊糖的羟基磷酸酯化就形成核苷酸核糖核苷酸：2`-、3`-和5`-核苷酸脱氧核糖核苷酸：3`-和5`-脱氧核苷酸自然界存在的核苷酸为5`-核苷酸核苷酸DNARNA核苷酸核苷戊糖D-2-脱氧核糖D-核糖碱基嘌呤碱嘧啶碱腺嘌呤、鸟嘌呤胞嘧啶、胸腺嘧啶腺嘌呤、鸟嘌呤胞嘧啶、尿嘧啶酸磷酸磷酸两类核酸的基本化学组成4.2.2核苷酸的性质1.一般物理性质无色粉末或结晶；易溶于水，不溶于有机溶剂；酸性溶液中不稳定，中性和碱性溶液中很稳定；具有旋光性

2.互变异构现象碱基上带有酮基的核苷酸能转化为烯醇式。3.紫外吸收在240~290nm有吸收，最大值在260nm附近。不同的核苷酸有不同的吸收特性。测定两个波长的吸收值之比260/280，判断样品的纯度。纯DNA的值为1.8，纯RNA的值为2.0。样品中如有杂蛋白及苯酚，比值即明显降低。4.核苷酸的两性解离4.2.3核苷酸的重要衍生物1.5`-二磷酸核苷酸和5`-三磷酸核苷酸核苷三磷酸化合物在生物体内的能量代谢中起着重要的作用。

ATP（三磷酸腺苷）在生物体内化学能的储存和利用中起关键作用；

GTP参加蛋白质和嘌呤的合成

CTP参加磷脂的合成

UTP参加多糖的合成2.环化核苷酸

核苷酸的5`-磷酸与核糖C3`的羟基结合成环。生理功能：作为激素作用的媒介物，参与调节细胞生理生化过程，控制生物的生长、分化和细胞对激素的效应。3.辅酶类核苷酸辅酶A（CoA）3`磷酸腺苷酸泛酸氨基乙硫醇酰基载体辅酶I（CoI,NAD)辅酶Ⅱ(CoII，NADP）黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）烟酰胺腺嘌呤核苷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸4.3核酸的结构4.3.1DNA的结构1.DNA的碱基组成四种主要的碱基：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。规律：Chargaff当量规则：A=T；G=C；1949年Chargaff发现A与T及C与G配对现象。ErwinChargaff(1905-2002)

ChargaffdiscoveredthepairingrulesofDNAletters,noticingthatAmatchestoTandCtoG.具有种属特异性；没有组织特异性。2.DNA的一级结构

指DNA分子中核苷酸排列的顺序。

核酸中核苷酸之间是通过3`，5`-磷酸二酯键连结。HHHp3.DNA的二级结构1951年，RosalindFranklin得到DNA分子的X-ray衍射照片，1953年，Watson与Crick解出了DNA的双螺旋结构，此为分子生物学上的大进步。DNA双螺旋结构的要点（1）DNA分子由两条DNA单链组成。两条链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反，即其中一条链的方向为5′→3′，而另一条链的方向为3′→5′。（2）嘌呤碱和嘧啶碱基位于螺旋的内侧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直，糖基环平面与碱基环平面成90°角。DNA双螺旋结构的要点（3）螺旋横截面的直径约为2nm，每条链相邻两个碱基平面之间的距离为3.4nm，每10个核苷酸形成一个螺旋，其螺矩（即螺旋旋转一圈）高度为34nm。DNA双螺旋结构的要点DNA双螺旋结构的要点（4）两条DNA链通过氢键相互结合形成双螺旋。碱基的相互结合具有严格的配对规律，即A与T结合，G与C结合，这种配对关系，称为碱基互补。A和T之间形成两个氢键，G与C之间形成三个氢键。在DNA分子中，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。DNA双螺旋的稳定性DNA双螺旋结构在生理条件下是很稳定的。维持这种稳定性的因素包括：氢键：两条DNA链之间可形成大量的氢键；碱基堆积力：碱基上的芳香环具有疏水性质，碱基的堆积使碱基之间发生缔合形成了碱基堆积力，芳香族碱基的堆积，在DNA分子内部形成了一个疏水核心，消除了介质中水分子对碱基之间氢键的影响，有助于氢键的形成。离子键：是磷酸残基上的负电荷与介质中的阳离子（如Na+、K+和Mg2+）形成的键。从而降低了DNA链之间因负电荷而产生的的排斥力，增加了DNA分子的稳定性。改变介质条件和环境温度，将影响双螺旋的稳定性。DNA双螺旋的种类Watson-Crick的DNA双螺旋结构是DNA钠盐在相对湿度为92%时的一种状态。M.Wilkins等将DNA的二级结构分为A、B、C三种不同类型。类型结晶状态螺距，nm每圈螺旋碱基对数碱基倾角ABC75%相对湿度，钠盐92%相对湿度，钠盐66%相对湿度，锂盐2.83.43.111109.320º0º6º左手螺旋DNA1979年，A.Rich等从d（GCGCGC）的X-射线衍射结果中发现，该片段以左手螺旋存在于晶体中，提出了左手螺旋的Z-DNA模型。

A-DNA、B-DNA及Z-DNA的比较A-DNAB-DNAZ-DNA外形每圈螺旋碱基对数螺距螺旋直径碱基倾角右手，粗短112.82.619右手，适中103.420左手，细长124.461.89

与DNA碱基顺序相关的特殊结构回文结构碱基顺序颠倒重复，具有2倍对称的DNA段落。镜像重复颠倒重复存在与同一条链H-DNADNA顺序具有多嘧啶-多嘌呤的特点，并具有镜像重复。1953年初提出了DNA的三螺旋模型LinusPauling(1901-94)

Thetitanoftwentieth-centurychemistry.Paulingledthewayinworkingoutthestructureofbigbiologicalmolecules,andWatsonandCricksawhimastheirmaincompetitor.Inearly1953,workingwithoutthebenefitofX-raypictures,hepublishedapapersuggestingthatDNAwasatriplehelix.4.DNA的三级结构DNA的三级结构：双螺旋链的扭曲或再次螺旋。如：超螺旋结构线状DNA形成的超螺旋环状DNA形成的超螺旋真核生物DNA的存在形式

真核生物DNA的三级结构是该DNA双链盘绕在组蛋白上形成的负超螺旋。这种以组蛋白为核心绕以DNA片段的颗粒称为核小体（nucleosome）。

完整的核小体由两部分组成，即核小体核心（nucleosomecore），以及连接各核心颗粒之间的区域称连接区（linker）。

DNA双螺旋——核小体——串珠状多核小体细丝——螺线管——超螺线管——染色单体1.RNA的碱基组成RNA中含有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶四种基本碱基。碱基配对：A=U；G=C4.3.2RNA的结构

2.

RNA的一级结构

RNA分子一级结构：指各核苷酸链中核苷酸的排列顺序。核苷酸间通过3`，5`-磷酸二酯键连接3.RNA的类型核糖体RNA（rRNA）信使RNA（mRNA）转移RNA（tRNA）含量80%5%10-15%功能和蛋白质一起组装成核糖体，是细胞内蛋白质合成的场所蛋白质合成的模板在蛋白质生物合成中起转运氨基酸到核糖体的作用4.RNA的高级结构大多数天然RNA分子是单链的，多数核苷酸链发生自身回折，形成双螺旋区；不能配对的碱基形成环状突起。这种构象就是RNA的二级结构。A-U

G-C双螺旋区tRNA的三叶草形二级结构特征：tRNA分子一般由四臂四环组成；氨基酸臂反密码臂二氢尿嘧啶臂TψC臂反密码环二氢尿嘧啶环（DHU环）TψC环可变环（额外环）反密码子7对5对4对5对tRNA的三级结构在三叶草型二级结构的基础上，突环上未配对的碱基由于整个分子的扭曲而配成对，目前已知的tRNA的三级结构均为倒L型TψC环DHU环反密码环mRNA的结构5'3'm7GpppAAA……An编码区AUGUAA多聚腺苷酸(polyA)帽子结构7-甲基鸟嘌呤核苷三磷酸真核细胞mRNA的3’-末端有一段长达200个核苷酸左右的聚腺苷酸(polyA)，称为“尾结构”，5’-末端有一个甲基化的鸟苷酸，称“帽结构”。真核生物mRNA与原核生物的不同之处

真核生物mRNA的特殊结构：5’-末端的帽结构：m7G-ppp5’-Nmp促进核糖体与mRNA的结合加速翻译的起始速度增强mRNA的稳定性3’-末端的polyA结构:参与mRNA从核内向胞质的转移增强mRNA的稳定性真核生物mRNA含有内含子:在核内需经过一系列的加工、修饰及剪接等去除内含子，转变为成熟的mRNA，进入胞浆。rRNA的二级结构原核生物核糖体中有三类rRNA：5SrRNA、16SrRNA和23SrRNA；真核生物核糖体中有四类rRNA：5SrRNA、5.8SrRNA、18SrRNA和28SrRNA；大肠杆菌16SrRNA大肠杆菌5SrRNA真核生物18SrRNA4.3.3核酸中核苷酸顺序的测定1.核酸酶（nucleases）能水解核酸的酶称为核酸酶。催化在水参与下磷酸二酯键的切断。a—产生5`磷酸末端b—产生3`磷酸末端核酸酶底物作用点外切核酸酶蛇毒磷酸二酯酶牛脾磷酸二酯酶RNA、DNARNA、DNAab内切核酸酶RNaseA枯草杆菌RnaseRnaseT1RnaseT2DnaseIDnaseIIRNA-PyRNARNA-GRNADNADNAbbbbab脱氧核糖核酸酶（DNase）

核糖核酸酶（Rnase）

非特异性核酸酶限制性内切酶（restrictionendonuclease）对DNA具有较高的碱基专一性，能使别DNA分子中特定的碱基顺序，并在特定的位置切割。产生粘性末端产生平整末端4.4核酸的性质1.性状和溶解度DNA为白色纤维状固体；RNA为白色粉末；微溶于水；不溶于有机溶剂；钠盐易溶于水2.粘度DNA溶液粘度极大；RNA比DNA粘度小。3.分子大小相对分子量都很大，DNA相对分子量的比RNA的大。

可用紫外分光光度计测定样品是否纯品：纯DNA:A260/A280=1.8纯RNA:A260/A280=2.0核酸含量1A相当于50ug/ml双螺旋DNA或40ug/ml单螺旋DNA（或RNA）或20ug/ml寡核苷酸。4.

吸收光谱核酸在240~290nm有紫外吸收，一般在260nm左右有最大吸收。摩尔磷吸收系数E（P）：以每升核酸溶液中1mol磷为标准，计算核酸的吸收系数。

W－每升溶液中磷的重量（g）

DNA：E（p）=6000~8000RNA：E（p）=7000~10000

5.变性、复性和杂交核酸的变性（denaturation）引起核酸变性的因素温度升高；酸、碱、射线；尿素等变性剂。变性后现象260nm紫外吸收值升高（增色效应）；粘度降低；沉降速度增加；失去部分或全部生物活性。

DNA的变性温度：加热DNA溶液，使其对260nm紫外光的吸收度突然增加，达到其最大值一半时的温度为DNA的变性温度（熔解温度，熔点Tm）。DNA的Tm值大小与下列因素有关G-C含量（G+C）%=（Tm-69.3）×2.44DNA的均一性均一性高，Tm较低。介质中的离子强度离子强度较低的介质中，DNA的Tm较低。大肠杆菌DNA在不同浓度KCl中的熔解复性（renaturation）变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。DNA的复性主要受以下因素影响：DNA的复杂程度：越简单越容易复性；DNA浓度的大小：越高越易复性；DNA片段的大小：越小越易复性；温度：比Tm低25ºC左右最易复性，如超过Tm再迅速冷却不能复性，热变性DNA缓慢冷却时才可复性。杂交（hybridization）两种来源不同具有互补碱基序列的多核苷酸片断在溶液中冷却时可以再形成双螺旋结构。杂交DNA分子DNA/RNA杂交分子6、沉降密度：RNA>双链DNA；环状DNA>开环、线状DNA单链DNA>双链DNA沉降速度：RNA>环状DNA>开环、线状DNA

4.5核酸的生物学功能4.5.1DNA是生物遗传的主要物质基础。DNA的复制方式—半保留复制4.5.2RNA与生物遗传信息的表达首先，DNA通过转录作用，将其所携带的遗传信息（基因）传递给mRNA,在mRNA、tRNA和rRNA的共同作用下，完成蛋白质的合成。中心法则生物的遗传信息从DNA传递给mRNA的过程称为转录。根据mRNA链上的遗传信息合成蛋白质的过程，被称为翻译和表达。1958年Crick将生物遗传信息的这种传递方式称为中心法则。mRNA是DNA的转录本，携带有合成蛋白质的全部信息。蛋白质的生物合成实际上是以mRNA作为模板进行的。遗传密码

4.5.3蛋白质的生物合成4.5.4遗传变异的化学本质DNA结构的改变将导致相应蛋白质一级结构（氨基酸顺序）的变化，从而引起生物特征或性状发生变异。所以，一切生物的变异和进化都可以认为是由于DNA结构的改变而引起蛋白质组成和性质变化的结果。DNA结构变化的类型及影响因素DNA遗传密码的改变主要有如下几种类型：碱基顺序颠倒，如TA被颠倒成AT；某个碱基被调换，如AT换成GC；③少了或多了一对或几对碱基，例如：5’ATGGCTATGC3’变成5’ATGGTATGC3’3’TACCGATACG5’3’TACCATACG5’基因突变由于DNA碱基顺序的改变引起生物遗传性状显著变化的现象，称为基因“突变”。(1)DNA分子中碱基互变异构DNA分子的碱基，存在酮式—烯醇式或氨式—亚胺式互变异构。不同的互变异构体形成氢键的方向和能力不同，有可能导致复制时出现错误。例如在正常情况下，A（氨式结构）与T（酮式结构）配对；当A以亚胺式存在时（几率非常小），则与C配对。(2)物理因素能够引起基因突变的物理因素主要包括：紫外线（UV）、高能射线和电离辐射等。当DNA受到大剂量紫外线（波长260nm附近）照射时，可引起DNA链上相邻的两个嘧啶碱基共价聚合，形成二聚体，例如TT二聚体。光聚合反应

胸腺嘧啶碱基在紫外光照射下，可以发生二聚加成反应：

在DNA分子中，如果两个胸腺嘧啶碱基相邻，在紫外光照射下，可能发生上述聚合反应，其结果是破坏了正常复制或转录。(3)化学因素化学因素是引起DNA结构发生变化的最常见因素，主要包括：烷基化试剂亚硝酸盐碱基类似物烷基化反应由于含氧碱基存在酮式和烯醇式的互变异构，烯醇式中的羟基可以被烷基化转变为稳定的烯醇醚。鸟嘌呤核苷烷基化形成6-甲氧基鸟嘌呤核苷后，不再与C配对，而与T配对。这种情况将引起DNA的复制、转录及信息表达出现错误。环外氨基的反应

胞嘧啶核苷在亚硝酸作用下，可以形成重氮盐，再转变为尿嘧啶核苷。因此生物体内亚硝酸的存在有可能改变DNA的碱基组成。腺嘌呤核苷和鸟嘌呤核苷也能发生类似的反应，分别形成次黄嘌呤核苷（I）和黄嘌呤核苷（X）。碱基类似物是一类结构与核酸碱基相似的人工合成或天然化合物，由于它们的结构与核酸的碱基相似，当这些物质进入细胞后能够掺入到DNA链中，干扰DNA的正常复制和转录。4.6核酸的分离、合成和鉴定原理4.6.1核酸的分离和纯化提取分离核酸的一般原则：破碎细胞，提取核蛋白使其与其他细胞成分分离；用蛋白质变性剂或蛋白酶处理除去蛋白质；获得的核酸溶液用乙醇等使其沉淀。4.6.2合成酶促合成法化学合成法4.6.3鉴定和含量测定含量测定1、定磷法RNA平均含磷量：9.0%DNA平均含磷量：9.2%2、定糖法核糖的测定脱氧核糖的测定3、紫外吸收法提要核酸分为两大类：DNA和RNA，所有生物都含有这两类核酸。核酸是线形多聚核苷酸，其基本结构单位是核苷酸；核苷酸又是由碱基、戊糖及磷酸组成。空间结构Watson-