实验3-硝酸还原酶活性测定

实验三硝酸还原酶活性测定

（p124-127）一、标准曲线制作二、硝酸还原酶活性测定植物对氮素的吸收和利用以无机氮为主：硝态氮（NO3-）和铵态氮（NH4+）铵态氮（NH4+）可以直接被植物利用硝态氮（NO3-）在植物体内还原成铵态氮才能被利用NO3－中的N为高度氧化态，而细胞组分中的N均呈高度还原态，被吸收的NO3-需经过还原后才能被利用硝酸盐的还原由硝酸还原酶(nitratereductase)催化。硝酸盐的还原硝酸还原酶硝酸还原酶存在于细胞液中，为一种底物诱导酶。诱导酶(inducedenzyme)

植物体本来不含有，但在特定的外来物质(如底物)的影响下诱导形成的酶NO3-诱导的大麦根系和地上部分硝酸还原酶活性变化NO3－的还原在根或叶中均可进行NO3－供应少时，主要在根中还原NO3－供应量大而根中还原力不足时，NO3－运到叶片进行还原亚硝酸盐还原为氨亚硝酸还原或在根中的前质体，或在叶中的叶绿体中进行。还原所需的电子来自还原态的铁氧还蛋白。亚硝酸还原酶的辅基由一个铁硫原子簇和一个西罗血红素组成NO3-还原为NO2-后，NO2-被迅速运进质体即根中的前质体或叶中的叶绿体，并进一步被亚硝酸还原酶（NiR）还原为NH3或NH4+。叶绿体叶绿体中，还原反应所需的一对电子由还原态铁氧还蛋白提供亚硝酸还原酶（NiR）亚硝酸还原酶（NiR）在细胞液里合成，运进质体时被加工NiR也可被NO3－诱导产生亚硝酸还原受光促进（照光植物生成还原态铁氧还蛋白）植物缺铁，亚硝酸还原受阻（铁氧还蛋白）1.实验目的1）理解硝酸还原酶的特性；

2）掌握硝酸还原酶活性测定方法。2.实验原理1）NR是诱导酶

在取样前一天外施50mMKNO3或NaNO3溶液、光照培养幼苗，诱导硝酸还原酶的产生。2）NO2-产生NO3-

+NADH+H+NO2-

+NAD++H2O测定反应溶液中NO2-含量的增加，即表现NR活性的大小。

NR3）NO2-含量测定—磺胺比色法。NO2-与磺胺在酸性溶液中NO2-形成重氮盐，再与α-萘胺偶联形成紫红色的偶氮染料，可以用分光光度计测定OD540。当磺胺与α-萘胺均过量时，所生成的红色深浅与NO2-含量成直线关系。NO2-含量标准曲线：[NO2-]（µmol/ml）=0.0026＋0.359OD540

4）硝酸还原酶活性计算方法NR酶活性（µmolNO2-/h•gfw）[NO2-]×5ml/1ml×10ml（鲜重g×0.5h）=3.材料与方法1）植物材料两种处理的小麦幼苗水（ck）KNO3（20000Lux，24hr，记作N）2）仪器设备分光光度计；天平；恒温水浴锅；真空抽气泵；剪刀；移液管；吸耳球；温箱；涡旋仪3）试剂A液：磷酸缓冲液：水：DNP溶液：蔗糖溶液＝5：5：1：1B液：磷酸缓冲液：KNO3：DNP溶液：蔗糖溶液＝5：5：1：1磺胺试剂α-萘胺试剂4.实验步骤1）水(ck)和KNO3（N）处理的小麦叶片各取2份（新鲜叶片中段），用蒸馏水洗净、搽干，剪成1cm小段，每份称取0.3克；将4份（ck、N）叶段分别置于含有10mlA、B（KNO3）溶液的两只试管中，即ckA、ckB、NA和NB四管；2）将四只试管放在真空干燥器中抽气30分钟，放气后摇晃直至叶段沉于溶液中；两种处理的小麦幼苗叶片中段各取0.3g水(ck)KNO3（N）10mlA液B液A液B液抽气30分钟25～30℃温箱中黑暗保温30分钟取1ml反应液+2ml磺胺试剂+2mlα-萘胺试剂混匀注意加液顺序25℃温箱反应5分钟取出后桌面静置15分钟540nm测定样品的吸光值取A液或B液1ml代替反应液作为对照管放气后摇晃直至叶段沉于溶液中3）将4只试管置于25～30℃温箱中黑暗保温30分钟；4）立即分别吸取1ml反应液，各加入2ml磺胺试剂，摇匀，再加2mlα-萘胺试剂（注意顺序），用漩涡仪混合摇匀，25℃温浴反应10分钟,取出后桌面静置15分钟；5）取A液或B液1ml代替反应液，加入2ml磺胺试剂和2mlα-萘胺试剂，作为对照管，在540nm测定样品的吸光值。表1硝酸还原酶的活性处理H2O（ck）

KNO3（N）

A液B液A液B液吸光度ODB-ODA[NO2-](unit)

NR活性(unit)

[NO2-]（µmol/ml）=0.0026＋0.359OD5405.实验结果记录注意事项1）摇晃直至叶段沉于溶液中2）磺胺试剂和α-萘胺试剂（加入时注意顺序）3）加入磺胺和α-萘胺后要混合摇匀，静置30分钟4）分光光