下一代测序技术的内容概览

下一代测序技术的内容概览高通量DNA测序技术（下一代测序技术NGS）在过去的15年里已经有了快速的发展，新的方法也在继续实现商业化。随着技术的发展，对基础和应用科学中的相关应用范围也在增加。这篇综述的目的是提供一个对NGS方法论的概述以及相关的应用。每个简要的讨论之后都跟有制造商和基于网页的可视化。关键词搜索，例如用Google，可能也会提供有帮助的网页链接和信息。方法的建立DNA测序方法的建立是Sanger双脱氧合成法以及Maxam-Gilbert的化学裂解法。Maxam-Gilbert化学裂解法是基于DNA的化学修饰然后在邻近修饰过的核苷酸附件的位点进一步裂解DNA骨架。Sanger测序采用了特殊的链终止核苷酸（双脱氧核苷酸）它缺少一个3‘0H连接位点。因此，不能够在DNA聚合酶的作用下合成磷酸二酯键，结果是正在伸长的DNA链在该位置终止了。双脱氧核苷酸是具有放射性的或者具有荧光标记的，便于分别在测序凝胶或者自动测序仪器上识别。尽管原始的Maxam-Gilbert方法的化学特性已经被进行修饰来帮助消除有毒性的反应物，但是Sanger测序通过合成双脱氧核苷酸的方法已经变成了一种测序的标准。Sanger测序法在1977年被创建，并且在UNIT7.4中被详尽的描述了。尽管通过当前NGS标准测序相对较慢，但是在Sanger末端终止法的改进，自动化，以及商业化这些方面已经使它能够在当前的多种应用范围中成为最适当的测序方法。特别的，超薄的凝胶板电泳已经被多通道毛细血管电泳代替了，逐渐还出现了自动填充可循环的毛细血管以及电动样品加样这对提高Sanger测序过程的速度与便利性有很大的贡献。在Sanger测序中已经出现的最显著的创新点有：（1）荧光染色的发展，（2）采用末端循环测序降低所要求的输入DNA的质量并且用耐热聚合酶高效准确的将终止物染色与正在伸长的DNA链结合起来，（3）解释和分析序列软件的发展。在自动化的Sanger测序项目中的主导者是AppliedBiosystem（AB）。当前商业化的AB测序仪全部使用的是荧光染色和毛细管电泳（CE）。用于DNA测序或者片段分析协议的机器的容量在发生改变，4组毛细血管（SeqStudioGeneticAnalyzer），8到24组毛细管（3500SeriesGeneticAnalyzer），以及48到96组（3700SeriesGeneticAnalyzer）。所以的这些测序仪产生了600-1000个碱基的正确的序列。尽管多年以来，不同种类基于Sanger测序的测序仪器已经被引进，包括来自Licor，Amersham，MilliGen，PerkinElmer和Dupont，所以的这些除了AB仪器都已经被停产了。Sanger测序技术在一些应用中任然非常有用，而这些应用中高通量测序是不被要求的。一些DNA测序的核心设备和以测序来获利的公司提供了Sanger测序服务。对于个体测序反应对公共的用法是在一个特殊的模板上用特殊的DNA引物，例如去检验质粒的构建和PCR产物。既然来自大量的商家的用于DNA纯化的分子生物试剂盒和试剂以及相对较高质量的合成产物都是可用的，这就使得甚至是相对较大的Sanger测序项目都能够在合理的时间框架和成本范围内完成。除了检测DNA的序列AB仪器上的毛细管电泳（CE）还被应用到测量酶对基于荧光标记的DNA底物的选择活性，列如，可以分析DNA片段的大小。毛细管电泳同样能够用来同时分析一个单反应中的多个底物，产物或者反应介质，通过不同的荧光标记。CE被用在DNA聚合酶和DNA连接酶动力学，以及包括冈崎片段和核糖核苷酸的删除修复的偶联酶通路的研究中。ABCE在在糖生物学中也是很有用的，可以用来分析荧光标记的多糖。第二代测序方法术语“下一代”隐含着DNA测序技术发展的下一步，同时也表明将会产生一个以下一代命名的新技术。我们更喜欢用下一代，第三代等这些术语，因为我们意识到上述的自动化的AB测序技术才是继采用放射性和凝胶板的Sanger测序技术之后的第二代测序技术。假定这个命名的保守性，对大基因组的高通量测序的低成本要求激发了一些第二代或者下一代测序技术的发展，这些技术除了采用自动化的Sanger测序之外，还用了大量的创新方法。由于自动化Sanger测序技术的商业化的实现，一些技术不再被使用（例如，Solid,Polinator,Helicos）。这些第二代测序技术和相关的方法将在下面进行描述。第二代测序技术能够被划分为两个主要的类别，通过杂交测序以及通过合成测序（SBS）。SBS方法是Sanger测序的进一步发展，没有双脫氧末端，结合了重复循环合成，成像以及不断将核苷酸加入到伸长链中的方法。第一映像，这些新的方法可能会非常昂贵，但是这些反应的同时进行都是以纳升、微升或者公升的体积在很小的空间内进行的，因此花在每个碱基测序上的成本是微不足道的。持续的精炼和缩小将进一步降低成本。关于成本要注意的一点是：测序完成的成本是多样化的，一些可能会忽视常规估计的每个“每个碱基的成本”。试剂成本通常取决于规定的容量，并且通常是与商家协商好的。例如，核心机构和测序中心会规定大量的测序会获得折扣价。成本通常不会包含劳动力和最后过程的生物信息分析。然而，一千美元就能测人类基因组这个目标或者降低每个碱基的成本是测序技术和研究机构要面对的黄金标准。通过杂交测序这个方法首先在1980年被发展起来，将已知序列的DNA的寡核昔酸放在过滤器上，然后与需要测序的DNA的标记片段进行杂交。通过重复杂交然后洗掉不是我们需要的未杂交的DNA,这个步骤可能是要确定杂交标记的片段是否与过滤膜上的DNA探针序列相匹配。基于来自于探针杂交点的重叠信息，因此它可以用来构建更大的连续序列的信息。通过杂交进行的测序被很大程度上投入到技术中，而这些技术主要依靠于采用特殊的探针去审核序列例如在医疗诊断方面的应用一在特殊的基因中识别与疾病相关的SNP（单核昔酸多样性）或者是识别染色体畸变（染色体重排，缺失，加倍，拷贝数变异（CNV））。通过合成进行的测序（SBS）SBS已经采取了一些不同的方法。第二代测序的方法通常采用一个固体的支持物来容纳微管道或者槽穴，在这些微管道（槽穴）中进行测序反应的发生通常，大部分新的SBS方法不会用双脱氧末端终止法，尽管在一些技术中也用到了可逆的终止末端，它能够允许在对加入的核苷酸进行成像的时候，核苷酸并入反应能够正常进行，然后将在标记核苷酸上合成的封锁基团移除，从而允许下一个碱基能够加入到序列中当前的SBS方法不同于原始的Sanger测序的方面主要是它们依赖于大量更短的序列（当前的片段大约是300到500bp）进一步，他们相比较于Sange测序来说具有本质上的gao错误率，并且，在识别一致序列的基础上，它们依赖于较高序列覆盖达到百万或者百亿的短的DNA测序片段（大规模平行的测序）作为获得正确测序的方式然而，对于一些技术来说，测序背景错误的发生不是总能够通过增加片段的数量来更正的。例如，当DNA包含同一个碱基的连续重复（如AAAAAAAA）时发生的均聚物序列。在这种情况下，测序平台在正确确认一致碱基的数目的时候就受到了限制每个平台都会产生它自己独特的一系列潜在的测序背景错误，用户们需要意识到这些局限性同时采用一些配备了不同技术的平台通常被用来避免这些问题长序列片段到短序列的转变的技术现在又朝着产生长原始序列的技术发展，在保持这些技术的大规模平行测序的同时这正在第三代测序技术中发生，尤其是第四代测序技术，将在下面进行描述这一部分是由于每个反应的成本，也有一部原因是我们想要获得尽可能长的原始序列来避免测序背景错误，如重复的DNA原件。大部分的SBS技术采用的方法是将要进行测序的单个DNA分子分散在上百万个分离的小井或者槽穴中，或者将其固定在固体支持物的特定位置上。DNA分子通过PCR扩增或者通过改良的“滚圈”放大的方法进行扩增，然后用标记过的核苷酸进行合成反应，或者进行基于一个特定核苷酸加入的化学反应，这些核苷酸都是可以进行成像或者能被检测的。大量的创新技术已经被创造出来使得上百万的DNA测序片段只在一个简单的测序过程中就行产生。测序的过程根据通量可能会持续数小时或者几天。454焦磷酸测序尽管已经被淘汰了，我们依然将这个技术当做第一种出现在市场上并且采用新技术的二代测序的方法，名义上，我们叫做焦磷酸检测，它是一种核苷酸插入的副产物，用来检测特定的碱基是否被插入到正在伸长的DNA链中。单独的DNA片段，长度为400到700bp,被固定在特定的转接器上，然后在在一个独立的乳状液滴中进行PCR反应。（emPCR）。珠子上的DNA序列与在转换器上的DNA序列互补，能够允许DNA片段直接结合到珠子上，理想的情况下，一个珠子上只有一个片段。DNA合成之后紧接着进行DNA合成反应的化学检测，化学反应发生在以微升计量的小槽穴中，焦磷酸被释放之后就可以在里面检测到。通过不断的用包含有四种核苷酸中的一种的测序试剂流过小槽穴，当正确的核苷酸被插入到合成的链中时，通过光发生反应就可以检测到焦磷酸的释放。光的强度同样提供了包含测序过程中出现的均聚物的信息，尽管在遇到大量同一种核苷酸测序会有一些困难。焦磷酸测序是在瑞典由焦磷酸测序AB发展起来的，并且随后被Qiagen获得，Qiagen在454生命科学上获得许可证，而在此之前它是属于Roche的。454测序仪在2013年停产了，尽管来自于一些供应商的实际还是可以继续使用的。454测序仪通常被用来进行基因组测序和宏基因组样本测序，因为它能够获得较长的测序片段（600到800bp）并且通量相对较高（2500万碱基，四小时一个循环，正确率达99%或者更高），促进基因组的组装。IonTorrent（离子激流测序仪）离子激流测序仪在一个半导体芯片上直接将核苷酸序列转变为数字信息。在一个DNA合成反应中，在一正在伸长的DNA链上，当一个正确的核苷酸被插入到与她互补的碱基的对面时，一个氢离子就会被释放。这改变了溶液的pH值，而pH值的改变可以被离子感受器记录为电压的改变，这更像是pH的测量。如果没有核苷酸被插入，就不会有电压峰值产生。使只含有四种核苷酸中的一种的测序试剂持续地流过并小槽穴，然后在洗掉，当合适的核苷酸被插入的时候，电压就会发生改变。当连个相邻的核苷酸插入同样的核苷酸的时候，两个氢离子会被同时释放，电压的改变就加倍。因此，一个种单核苷酸链的测序也可以被确定。然而，同一核苷酸组成的较大的均聚物链有时是很难被识别到的。离子激流测序反应发生在上百万个小槽穴里，上面覆盖有一个包含百万像素的半导体芯片，它能将化学信号转变为序列信息。为了使程序开始进行，DNA被打断成200到1500bp的片段然后结合在介面卡上。通过珠子和介面卡上的序列互补，DNA片段被附着在珠子上，然后通过emPCR进行扩增。这个过程能够使上百万个珠子每个都有一个DNA片段的多个复制片段。然后珠子通过包含每个小槽穴只能容纳一个珠子的芯片，当当测序试剂流过小槽穴时，如果正确的核苷酸被插入，就会释放出一个氢离子，信号随之被记录下来。这个系统的一个主要优势是不需要照相机，光源或者扫描器；核苷酸插入之后可以立刻被转变为能够进行直接记录的电压，极大地加快了测序的进程。离子激流系统由ThermoFisher出售，并且这个平台的很多版本都是可用的，包括PGM系统，。。。。。，每个的通量特性都不同。一个自动化的文库和模板准备系统同样是可用的。很多应用都是被支持的，包括靶向和体外DNA和RNA测序，转录组测序，微生物测序，拷贝数量变异检测，小RNA和MiRNA测序以及CHIp-seq（染色体免疫共沉淀测序）。Illumina技术到目前为止，在二代测序领域中占主导地位的是Illumina,ta采用的技术首先由Solexa和LynxTherape开发出来。Illumina测序是基于桥式扩增技术发展起来的，桥式扩增技术就是将DNA分子的每个末端固定在介质面上，然后使扩增反应在包含有与连接配适器互补的寡核苷酸序列的固体支持物上进行（玻璃支持物）。划片上的寡核苷酸之间嵌入了这样的DNA,然后接下来进行数轮的扩增，每个寡核苷酸片段形成大约1000个克隆的克隆簇。每个玻璃载片能够承受上百万个平行的簇反应。在合成反应的过程中，所以修饰过的核苷酸都与四种核苷酸中的每一个一致，每个都带有一个不同的荧光标记，这些被修饰过的核苷酸一旦被插入到合成链中，就能把检测到。这种核苷酸同样也能作为每个合成反应的终止物，但是在检测完之后能被解除终止进而进行下一轮的反应。反应要进行300次或者更多的循环。使用荧光检测增加了检测的速率，因为可以直接进行成像，与需要照相机进行成像的过程完全相反。Illumina测序支持不同的测序协议，包括基因组测序，外显子组测序和靶向测序，宏基因组测序，染色体共免疫沉淀测序，以及甲基化组检测。不同的Illumina测序机制提供的通量水平是不同的，包括。。。。。。。。。。每种仪器的详细介绍以及对特殊测序项目的容量可以从网站上寻找。Illumina测序引起的一个问题是，在所有克隆簇之间的合成反应缺乏同步性，使得不能产生正确的一致序列，降低测序的循环次数可以克服这个问题。我们同样要注意不要在支持物上产生过多的克隆簇，因为我们需要将正确数量的DNA模板正确排列。因为产生的数据量很大，要分析从测序过程中产生的测序错误是要能够被检测的，以帮助我们正确区分真正的序列突变体和测序方案导致的人为错误。第三代测序（大段分子片段测序）与第二代测序方法不同，第三代测序方法的目的是为长的DNA分子进行测序。当前在这个行业中商业化的技术先驱是PacificBioscience，它已经将两个测序系统实现商业化，即原始的RSII模型和最近的Sequel。PacBio测序同样被当成单分子实时测序，它使很长的DNA分子片段都能够被测序，长度为30到50kb，或者更长。SMRT（单分子实时测序）方法包括建造一个设计的DNA聚合酶，能够与被测序的DNA结合，放置在小槽穴的底部（零模导波，或者ZMW,在一个SMRT的流通池里）。一个ZWM是一个小室，它能够指引光进入到一个相对于光照波长来说范围很小的区域。由于所用光的ZMW设计和波长，成像仅仅会发生在ZMW的底部，在那里DNA聚合酶结合到DNA上，然后插入每一个碱基到正在伸长的链上。四种核苷酸都被标记上不同的连接由磷酸基团的荧光标记，以便用来进行不同的检测。如果一个核苷酸被插入到正在合成的链中，当正确的荧光标记的核苷酸被结合时成像以毫秒尺度发生。核苷酸嵌入完成之后，带有磷酸基团的荧光部分被释放，然后从ZMW的底部流走，并再也不能检测到。下一个核苷酸可以被继续加入。成像与核苷酸嵌入的比例是同时的，这样每个碱基就能被识别，当它被嵌入到正在合成的核苷酸链中时。这同时发生在上百万公式的ZMW中，展示在SMRT细胞中的一个单芯片上。在PacBio过程中模板准备是独一无二的，因为它涉及到一个SMRT的所以产物，一个环状的双链DNA分子带有一个已知的配适序列能够与引物互补，用来在模板上起始DNA的合成。这使得聚合酶通过历遍每个ZMW中的环状分子，次通读整个大的模板知道聚合酶停止，这样能够形成一致的序列（环状一致序列CCS）。当配适序列连接到插入的每一侧带有每个DNA合成起始位点的时候，测序酶能够在另一条DNA链上，从5‘端到3‘端历遍环状的SMRTbell，从dsSMRTbell的两条链中都能获得互补信息。PacBio实时测序的一个重要优势就是成像和检测过程就是在DNA合成过程中能检测到的每个核苷酸添加的速率，称为插入空格持续时间（PD）。大量（不是全部）带有碱基修饰的核苷酸，列如一些腺嘌呤和胞嘧啶的甲基化，改变了IPD因此能够被当成修饰过的碱基识别。大量不同的修饰都能够被检测并且根据后续的研究进行分类。在这一点上，不是所有的修饰都能够被识别到，包括m5C，因为它造成的IPD的修饰很小。然而，通过化学识别也能够实现这类核苷酸的检测。PacBioSMRT测序本身就自带有较高的错误率，但是通常是可以避免的，由于在每个SMRTbell模板的ZMW中获得的片段通量的深度。因为错误是随机的而不是系统的，因此多次对模板进行测序并且与将个体序列片段进行比对能够获得高精确度的CCS片段。进一步的,多个模板的相似序列提供了额外的一致性。PacBioSMRT测序比之前的方法多了一些优点。它除了能够提供大的测序片段以便DNA组装之外，还能够快速的识别甲基化位点以便进行后续的研究。列如，采用PacBio技术能够相对简单的组装一个完整的细菌基因组序列，仅仅用一些SMRT小室，而且还能够确定里面的甲基化模式。通常，PacBio组装是与其他技术联合使用的，例如Illumina测序，以获得更高的精确度。就通量而言，PacBioRSII用的是有150000个ZMW的芯片，当经最佳使用时，每个SMRT小室能够产生多达350百万碱基的序列。采用泊松分布能实现最优化，以至于每个小室中只有一个聚合酶结合在DNA分子上。最近的PacBio仪器，Sequel，有一百万个ZMW并且能够产生约365000个片段，平均长度为10――15kb。随着化学和技术的不断更新(例如磁力珠载体)，以及使用SAGEPippin来分离大的DNA片段，PacBio测序被设计提供更多更长以及更精确的测序片段。第四代尖端技术它可以使长DNA分子穿过小直径的孔，并且测量不同的通量，当每个核苷酸通过一个连接的检测器的时候。在理论上，超过100kb的DNA分子能够穿过纳米孔，并且有很多通道时，数十到数百Gb的序列能够以相对较低的成本获得。两种类型的纳米孔系统正在被发展用以DNA测序，即生物膜系统和固态感受器技术。生物纳米孔测序主要依赖于使用跨膜蛋白嵌入到一个脂膜中，从而产生孔洞。两个蛋白质被用来产生孔洞，而且已经被深入的研究过：a-溶血素和分枝杆菌阴茎垢孔蛋白A(MspA)。DNA从孔中穿过的速率由添加的马达蛋白规定，例如一种高度前景的DNA聚合酶(phi29),在加入核苷酸之后，会使DNA不断变化。其他配件蛋白，例如一个DNA解旋酶，核酸外切酶I,或者链接到DNA链上的寡核苷酸，使解旋和链接的DNA核苷酸通过纳米孔已进行检测。DNA能够以成百上千个核苷酸的连续速率移动穿过小孔。固态感受器技术采用的是不同的材料或者金属合金支持物，带有纳米级的小孔，使得DNA或者RNA能够通过。以纳米孔为基础的DNA序列首先在20世纪90年代提出，然后由带有一个便携式MinION的ONT在最近实现商业化,，，，，，，，，，，，，，，这些测序仪用的蛋白质纳米孔是在一一个耐电的高分子膜上，当每个核苷酸通过检测器的时候，高分子膜的特性就会发生改变。长的双链DNA分子首先被结合在一个前进的酶上，例如phi29聚合酶。当复合体通过纳米孔的时候，一个DNA链进入纳米孔以及通过孔的迁移率被DNA聚合酶的合成以及转移牵制。前进的酶能够使DNA持续并快速地轻松地穿过它。当一个核苷酸通过小孔，它就打断了一个已经使用到纳米孔的电流。每种核苷酸提供了一种特性的电子信号，能够被记录成一个电流干扰事件。记录是实时的，并且当10kb的片段也是合理通过的,在理论上，100kb的DNA能够通过纳米孔并且被检测到。一旦DNA离开一个纳米孔，这个小洞对其他不同的DNA分子就是可用的。因为MinINO小巧便携的尺寸，它有可能应用到许多领域中，这些应用对容量或者空间要求都是非常高的。当前的错误率相对较高，但是由于也使用到其他高通量测序方法，这可以被用大量要被测序的分子来纠正。纳米孔技术已经被用到测序环境和宏基因组取样中，它当前可以在太空站使用，并且已经被用来鉴定菌株。病毒基因组，环境监测以及单倍型监测已经可以通过MinION实现。内米孔技术同样能够用来识别碱基修饰，与PacBio技术一样，能够使后生事件被准确地识别出来。纳米孔测序同样提供了直接的DNA测序方法，以及不需要PCR的cDNA测序。因此，纳米孔测序有潜力提供相对低成本的DNAheadRNA测序，环境监测以及基因组性分析。用于高通量测序和完成大兴基因组计划的辅助方法光学映像尽管最近高通量单分子长阅读片段测序方法遥遥领先，但是，在基因组中，其他的方法也能用来完善或者证明不同DNA片段重叠群的顺序。这些方法中最流行的是光学映射，使用基于序列的核苷酸位置沿长DNA分子分布的标记方法。这些方法为将已知的基因定位到基因组图谱上提供了大量的支架。通过沿着DNA大分子（与限制性酶切位点图谱的原理一样）创造一个可见的物理图谱，这是一个可以将DNA序列和物理定位连接起来的方法。这个方法首先由DavidC创造出来，但是其他的方法学同样被用来创造光学图谱。纳米流体方法，是一种新的方法来使DNA分子中特定位点可视化并识别出DNA分子中的特定位点的方法，并且片段的生物信息学成像捕获和分析已经在技术中逐渐得到提升。光学映像对于完善大的基因组项目（染色体组尺寸重叠簇）以及其他应用是非常有用的，例如基因组中的重排现象的识别。它同样能被用来辅助基因组组装，基因组结构对比，以及校正基因组组装的错误。它也能被用来比较菌株差异性，例如在医学微生物学中的应用。这个方法的一个主要优点是它避免了克隆或者PCR的手动过程，并且可以同时对一个单分子进行分析。然而，人工操作也可以被引入，因此复杂的片段可以被用来构建一个连续的图谱。这个方法的优点超越了脉冲场凝胶电泳的行业标准，对于创造较大的DNA分子片段染色体图谱。光学映像是非常节约时间的，并且除了提供片段的大小信息，还提供了路线图位置能够被用来构建一致的染色体图谱。通常，光学映像由将基因组DNA剪切呈大小为100mb到1gb片段大小开始。关键是将这些大的DNA片段在特定的内置位点进行标记，这样可以使得标记的分子能够被成像并且与所提供的重叠图谱在一条线上。一些方法能够被用来标记特殊的基因组位置，包括用限制性单末端或者较少切点的限制性酶消化过的DNA位点，或在特定消化位点消化的一系列酶消化过的DNA位点。标记能够在一个自由末端上进行，可以采用特殊染色的方法，或者采用单链裂解酶和高分子染色剂的插入来进行酶的填充反应。与DNA在特殊位点结合的酶同样能够被采用（例如DNA甲基转移酶），在该位置，一个标记在结合之后能够从酶转移到DNA上。标记过的A+T或者C+G富集的DNA位点同样能够被使用。结果片段能够被连接到玻璃载体的表面或者结合到细长的线性管子，采用合适的显微镜用来成像。一旦被固定在固体介质上，这个分子就被物理性的进行延长。然后它们能够被按大小进行分类，然后对位点进行标记，成像，然后记录，创造一个分子的光学图谱：通过结合来自于多个DNA分子的成像，一个重叠的大的一致的光学图谱能够被制造出来，这个在之后可以用来当做固定其他物理材料，序列或者重叠片段的支架。在这个领域的商业领导者是生物纳米基因组。。辅助技术DNA剪切所有DNA测序方法的关键步骤就是将DNA片段打断呈特定的尺寸。一些剪切和扩增片段DNA的设备都可以用来分离不同尺寸的DNA，从而用以构建文库。CovarisInc.ShearingC.I提供了一些声学的剪切技术和耗材可以将DNA和RNA打断成合适的片段大小，用以DNA和片段文库的准备（150bp到5kb）并且同样为染色体和RNA剪切提供了方案。为了将更大的片段分离，他们提供了G-TUBE，主要是致力于将DNA剪切成大片段，平均尺寸在6kb到20kb，这要求在室温条件下进行。g-TUBE与一连串顶端的连续重叠片段一起发挥作用，最终DNA片段的尺寸大小是由加速度变化率和离心机的速率