【课件】选修三 1.2基因工程的基本操作程序 课件

1.2基因工程的基本

操作程序目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定基因工程的基本操作程序基因工程的目的基因－－编码蛋白质的基因。与生物抗逆性相关的基因与优良品质相关的基因与生物药物和保健品相关的基因与毒物降解相关的基因与工业所需酶相关的基因具有调控作用的因子……3、化学方法人工合成1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增(基因比较小，序列已知)基因文库基因组文库部分基因文库－－如：cDNA文库多聚酶链式反应一、目的基因的获取（一）从基因文库中直接获取按照外源DNA片段的来源：从特定组织提取的染色体基因组DNA ---基因组文库（总）mRNA反转录成的cDNA拷贝----cDNA文库（部分）②基因文库的目的在不知目的基因序列的情况下，获得所需的目的基因。①基因文库的分类将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因组DNA文库cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库的比较非编码区非编码区编码区与RNA聚合酶结合位点启动子终止子①RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。②转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。③转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。1、编码区：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质的序列。2、非编码区：调控遗传信息表达的核苷酸序列(启动子、终止子），不编码蛋白质。原核细胞的基因结构（补充知识）真核细胞的基因结构（补充知识）编码区非编码区非编码区

内含子

外显子

启动子终止子与RNA聚合酶结合位点1、编码区2、非编码区：调控遗传信息表达的核苷酸序列(启动子、终止子），不编码蛋白质。外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列非编码序列：包括非编码区和内含子基因组文库与部分基因文库的关系基因组文库和部分基因文库的比较文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中内含子基因多少物种间基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以从基因文库获取目的基因根据目的基因的有关信息，如：基因的已知核苷酸序列；基因的功能；基因在染色体上的位置；基因的转录产物mRNA；基因的表达产物蛋白质……以目的基因转录成的信使RNA为模板，再反转录酶的催化下反转录成互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA，即cDNA，从而获得所需的基因。反转录法（cDNA文库的构建方法）（二）利用PCR扩增目的基因1、过程高温变性（加热至90～95℃解旋为单链）低温退火（复性）（引物与单链互补结合）适温延伸（在Taq酶的作用下合成与模板互补的DNA双链）重复循环冷却至55～60℃加热至70～75℃PCR扩增仪引物是一段短的单链RNA或DNA片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，使DNA聚合酶能够从其3′端开始连接脱氧核苷酸。引物：原料4种游离的脱氧核糖核苷酸(dNTP)，包括dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dUTP等在内的统称，N代表变量指代A、T、G、C中的一种。2、条件酶Taq酶（热稳定的DNA聚合酶）适宜的温度和PH值已知基因的核苷酸序列使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增4、结果3、方式：以指数方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）2nPCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞核内Taq酶（热稳定DNA聚合酶）细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列目的基因推测推测化学合成根据已知的氨基酸序列合成DNA法：（3）人工合成目的基因DNA合成仪(基因比较小，序列已知)文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中内含子基因多少物种间基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以问题一：关于物种间的基因交流？五碳糖磷酸含氮碱基O12345问题二：3‘和5’端如何判定？PCPTPAPGPTAPGPCP5’3’3’5’——基因工程的核心1、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。二、基因表达载体的构建质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种2过程:3.基因表达载体的组成：它们有什么作用？a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因结构基因RNA聚合酶半乳糖苷酶酶酶

RNA聚合酶启动子RNA聚合酶启动子：位于基因首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。思考1：表达载体为什么一定要有启动子？（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。思考2：终止子的作用是什么？

终止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。

是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。思考3：标记基因有什么作用？三、将目的基因导入受体细胞－转化农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射技术感受态细胞法受体细胞植物细胞动物细胞微生物细胞转化：目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达（1）农杆菌转化法①特点：

易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力②原理：

Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。③转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转入农杆菌（1）农杆菌转化法基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒（常用钨粉粒子和金粉粒子）表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。（2）基因枪法适用于单子叶植物（3）花粉通道法植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。适用于被子植物2.将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）思考：为什么要用受精卵而不用体细胞？（2）操作程序:提纯含目的基因表达载体取受精卵显微注射移植到子宫受精卵发育新性状动物常用法：Ca2+处理法/感受态细胞法常用菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA3.将目的基因导入微生物细胞思考：为什么要用Ca2+处理受体细胞？用Ca2＋处理，增加细菌细胞壁的通透性吸收周围环境中的DNA分子的生理状态四、目的基因的检测与鉴定接种实验抗原－抗体杂交分子杂交技术DNA分子杂交技术受体是否具有转基因特征个体水平目的基因是否翻译目的基因是否转录目的基因是否插入分子水平方法检测对象抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因——DNA分子杂交技术——分子杂交技术用上述探针和转基因生物的mRNA杂交，若出现杂交带，表明目的基因转录出了mRNA检测目的基因是否转录出了m