噬菌体抗体库在水产养殖过程中的应用研究综述,渔业论文

噬菌体抗体库在水产养殖过程中的应用研究综述,渔业论文抗体库(Antibodylibrary)技术主要是通过PCR技术克隆全套抗体重链和轻链可变区基因，重组、构建到特定的表示出载体中，在原核或真核生物体内表示出出具有生物学功能的抗体分子，并通过亲和挑选获得特异性抗体。噬菌体抗体库(Phageantibodylibrary)技术是迄今为止发展最成熟、应用最广泛的制备抗体的技术，它是一种将PCR技术和噬菌体展示技术相结合，并在噬菌体外表表示出、分泌，经过挑选后获得特异性抗体的技术。噬菌体抗体库技术的基本原理是将外源DNA片段插入噬菌体编码蛋白基因中，使外源DNA片段的表示出产物与噬菌体的外壳蛋白融合，展示于噬菌体外表，具有操作简单、低成本以及技术成熟等特点，在商业生产中被成功应用。当前，噬菌体抗体库分为Fv、Fab、单链抗体(Single-chainantibodyfragment)、单区抗体(Singledo-mainantibody)和双链抗体(Diabody)等类型。单链抗体主要通过15个氨基酸序列(Gly4Ser)3linker将重链和轻链连接起来，具有体积小、免疫原性低的特点，不易引起人体或动物排挤反响。因其无抗体Fc段，不易与具有Fc受体的非靶细胞结合，由于片段分子量较低，能够有效穿透致密的组织屏障到达病灶部位，在医疗诊断和疾病治疗等方面具有广泛的应用前景，成为当代生命科学、生物医学领域的一大热门，被以为是21世纪的阳光产业。近年来，噬菌体抗体库技术已逐步应用到水产养殖领域，在养殖病害防治、药物残留检测、水体水质监测以及食品安全控制等方面已经有不少报道。另外，也有学者将抗体库技术与抗体芯片结合对多种水体病原菌进行高通量检测，为抗体库在水产养殖领域的应用提供了更广阔的前景。1、噬菌体抗体库在水产病害防控中的研究1．1细菌性疾病的防治我们国家是水产养殖大国，水产品年总量约占世界总量的70%。由于环境的污染及水产养殖业本身的高密度、集约化生产，导致养殖病害时有发生，每年造成近百亿元的经济损失，华而不实细菌性疾病造成的危害和损失尤为严重。副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一种食源性的病源微生物，广泛存在于浮游生物及海产品中，不仅能够引发海产品的败血症，还会导致人的食物性中毒，引起恶心、呕吐和腹泻等肠胃炎疾病。当前对于副溶血弧菌的致病机理尚不清楚，缺乏有效的预防与治疗手段。三型分泌系统(T3SS)是已经知道副溶血弧菌致病的主要因子之一，而T3SS毒力因子的运输管道Needle在其致病经过中起着决定性作用。方遂等通过Overlap-PCR将VH、Linker和VL组装成完好的scFv基因，同时将scFv基因克隆到噬菌体载体pCANTAB-5E上，成功构建了噬菌体单链抗体文库，测得该文库库容量约为1．4107cfu/ml。经过富集、淘洗得到2株验证无误的单链抗体，经氨基酸序列分析发现2株菌株可视为1株单链抗体，ELISA检测结果表示清楚所挑选的单链抗体具有较高的抗体特异性。由于副溶血弧菌具有多个治病因子，将挑选到的单链抗体与副溶血弧菌的其他致病因子抗体结合，可制备多功能抗体，控制和治疗副溶血弧菌的发生和扩散。鳗弧菌(Vibrioanguillarum)是海水鱼及淡水鱼中的重要致病菌，能够感染虹鳟、鳗鲡、鲈鱼、黄鱼、石斑鱼等几十种鱼类，致死率较高，在我们国家特别流行。夏永娟等成功构建了抗鳗弧菌独特型单克隆抗体dsFv基因，并使其准确的在M13噬菌体外表获得了呈现。通过ELISA检测发现抗鳗弧菌独特型dsFv噬菌体能够与抗原特异性结合，抗独特型抗体能够模拟抗原表位，能够作为疫苗使用，而抗鳗弧菌独特型dsFv噬菌体能够通过细菌繁衍大量获得，降低了疫苗的成本。该dsFv噬菌体有望成为用于预防鱼类鳗弧菌感染的新一代基因工程疫苗。1．2病毒性疾病的防治草鱼呼肠孤病毒(Reovirusofgrasscarp，GCRV)是我们国家分离的第1株鱼类病毒，是引起我们国家草鱼幼鱼出血病大面积爆发的主要病原体，这种疾病一旦爆发，其死亡率可高达85%。陈丛琳等从已构建的小鼠天然噬菌体展示抗体文库中淘选并获得了能够特异性辨别草鱼IgM的单链抗体，并在已鉴定的单链抗体阳性克隆中，挑选出对草鱼IgM有较好的特异性结合的单链抗体C1B3。结果表示清楚，相对于病毒的其他构造蛋白而言，VP7在草鱼中能产生更强的免疫反响，由此推导VP7应是用于疫苗设计的首选抗原。该研究通过单链抗体，为草鱼呼肠孤病毒及其他鱼类病原体重组疫苗的研发提供了重要的分析手段和策略。张晓华等利用实验室构建的大容量天然噬菌体展示单链抗体文库成功获取了能够辨别GCRVVP7的单链抗体，此抗体将成为后面进一步研究病毒与细胞互相作用的有效工具。对虾白斑综合症病毒(Whitespotsyndromevirus，WSSV)为已经知道基因组最大的动物病毒，严重危害水生甲壳动物养殖业。王晓洁等从抗WSSV单抗的细胞株中，采用间接荧光检测法挑选出8株分泌较强的抗WSSV单抗的细胞株，可用于白斑综合症病毒快速检测试剂盒的研制。试验采用双抗夹心免疫层析法，制成快速检测、诊断WSSV的试纸条，整个反响只需5min，与以前检测WSSV较快的斑点免疫印迹法需要3h相比，在很大程度上提高了检测速度。白斑综合症病毒检测试纸条是一种快速、简便、准确、合适于现场使用的WSSV检测、诊断试纸条，且无假阳性。此试纸条尤其适于养殖人员现场、时事跟踪、监控、检测，可为白斑症的预防提供可靠的监测根据。2、噬菌体抗体库在水环境监控的研究2．1药物残留检测当前，用化学药物和抗生素治疗鱼类细菌性疾病是常用且较为有效的方式方法，但同时具有很多弊端，如药物和抗生素在水产品中的残留、病原生物耐药性加强、水域生态污染等。在寻求病害防治的其他方式方法时，传统的杂交瘤技术获得的抗体不仅费时费力，而且制备经过较为复杂，无法知足高通量的需要，噬菌体抗体库技术获得的抗体具有简单、快速、高通量的优点。磺胺类药物(Sulfonamides，SAs)为化学合成抗菌药，由于其具有广谱抗菌活性，且价格低廉，应用广泛，在医学和动物的感染性疾病防治中具有重要地位，但不合理的使用容易引起过敏反响，造成耐药菌增加，且动物性食品中残留的药物可能对人们的健康造成潜在的危害。赵琳等成功构建斑点叉尾鮰天然Fab噬菌体抗体库，最终得到的库容量约为5．67107cfu/ml。在这里抗体库的基础上，闫晓敏等以偶联卵血清蛋白的磺胺甲氧嗦(OVA-SMP)和磺胺甲恶哇(OVA-SMZ)为固相包被抗原，挑选并获得了特异性较强的Fab抗体。王辉等成功建立了斑点叉尾蛔单链抗体(ScFv)抗体库，并测定其库容为5．8105cfu/ml。以OVA-SMZ为包被抗原，挑选到针对OVA-SMZ的抗体。2．2水质监测在养殖经过中，投入过量的营养物质、大量施肥和投饵等可导致水体中的氮、磷超标，进而引起藻类和浮游生物过度繁衍，严重影响养殖的成活率。微囊藻素是从蓝藻水华中分离出来的多肽毒素，能够强烈抑制蛋白磷酸酶的活性，对水产养殖和水体环境的危害比拟严重。已有大量文献报道微囊毒素对鱼类的危害，微囊毒素主要危害鱼类鳃、肝、肾、消化器官、循环系统和免疫系统等。Zhao等利用噬菌体抗体库技术以微囊藻毒素为包被抗原，从构建的噬菌体抗体库中成功挑选到特异性目的抗体，得到的目的抗体能够快速简单地对水体中微囊藻素进行监测，在水体水质检测上具有广阔的应用前景。3、噬菌体抗体库在水产品安全控制的研究长久以来，河豚鱼被以为是东亚以及东南亚居民餐桌上一道美味的鱼类食物，但由于河豚毒素有剧毒，因而每年都会发生30～50例河豚鱼中毒的事件。河豚毒素(Tetrodo-toxin，TTX)是河豚鱼中最主要的一种毒素成分。刘立才等成功构建抗河豚毒素(TTX)的重组的单链抗体(scFv)展示文库，库容量为1．5106cfu/ml，经过6轮的淘选经过，获得了与河豚毒素特异性结合的抗体，该抗体库的构建为快速检测河豚毒素提供了基础。在热带和亚热带海域珊瑚礁的附近，有400多种鱼因食用毒藻类而被毒化，华而不实包括梭鱼、黑鲈和真鲷等重要海洋经济鱼类，这些鱼类统称为雪卡鱼。这些雪卡鱼体内都含有雪卡毒素，是一种可引起人类中毒的珊瑚鱼毒素，毒性极强，比河豚毒素的毒性强20倍。雪卡毒素主要存在于肌肉、内脏和生殖腺中，可引发神经性中毒。Nagumo等通过噬菌体抗体库技术成功挑选出抗雪卡鱼毒素的特异性抗体，为今后雪卡鱼毒素的研究及其检测奠定了基础。4、噬菌体抗体库与抗体芯片结合的研究抗体芯片(Antibodymicroarrays)是一种特殊的蛋白质芯片，又称抗体微阵列，具有高特异性、高灵敏性、高通量及多样品或多指标平行分析的优点，是免疫学研究的一种新技术，已被应用到很多领域。王欣欣等用抗体芯片成功的对海豚链球菌(Streptococcusiniae)、延迟缓慢爱德华氏菌(Ed-wardsiellabacterium)、杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida)、鳗弧菌(Vibrioanguillarum)、海洋分支杆菌(Nontuberculoausmycobacteria)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、海洋分支杆菌(Nontuberculoausmycobacteria)等6种细菌进行了准确检测。在这里试验中，应用硫酸铵分级沉淀法进行兔抗血清的纯化，这能有效去除免疫血清中的非特异性抗体和杂蛋白，降低兔抗血清的非特异性吸附，进而使其与其他菌株的穿插反响降到最低。通过ELISA对6种细菌与各菌株兔抗血清之间的穿插反响，分析发现纯化后穿插反响明显减小，用吸附纯化后的抗体构建的病原菌检测抗体芯片的特异性显著加强，因而可用于水产养殖病原菌的准确检测。廖玮等利用pⅧ展示系统成功改良噬菌体抗体芯片，由于pⅧN端有多个带电氨基酸，会增加非特异性吸附，这些带电氨基酸会被阳性噬菌体上的融合抗体分子屏蔽，减少对蛋白质的吸附，进而降低了背景。降低pⅧ的非特异吸附，不仅能够提高芯片的灵敏度，而且能够降低非特异结合的背景，提高淘选效率，大幅度提高了噬菌体抗体芯片的灵敏度和信噪比，同时可为抗体库在水产养殖领域的应用提供了新途径。5、瞻望综上所述，随着生物技术的不断发展，噬菌体抗体库技术展现出了宏大的应用前景，已成为解决生物学和医学等问题的重要手段。同时随着水产养殖业的日益发展，噬菌体抗体库技术在水产养殖中的应用也具有广阔的前景。但是，由于抗体库技术在水产