免疫印迹技术课稿

免疫印迹技术课稿

雕版印刷是最早在中国出现的印刷形式，在印刷史上有“活化石”之称，扬州是中国雕版印刷术的发源地，是中国国内唯一保存全套古老雕版印刷工艺的城市。雕版印刷术是一种具有突出价值且民族特征鲜明、传统技艺高度集中的人类非物质文化遗产。它凝聚着中国造纸术、制墨术、雕刻术、摹拓术等几种优秀的传统工艺，最终形成了这种独特文化工艺；它为后来的活字印刷术开了技术上的先河，是世界现代印刷术的最古老的技术源头。基本内容免疫印迹技术的原理1基本操作流程2注意事项3免疫印迹技术的应用4课堂小结5作业6一、免疫印迹技术的原理通过SDS区分不同大小的蛋白组分，并转移至固相支持物（硝酸纤维素膜），通过特异性试剂（抗体）作为探针，与固相支持物上的蛋白质（抗原）发生抗原抗体反应，再通过显色反应对靶物质进行检测。蛋白质的Westernblotting技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。④③②

①电泳结果检查电泳测定蛋白样品浓度收集或提取蛋白样品二、基本操作流程1、SDS1、SDS

①收集或提取蛋白样品可以使用适当的裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，用SDS上样缓冲液，裂解能力强，能提取细胞总蛋白。另外，常用的还有非离子去垢剂缓冲液裂解法，低渗缓冲液裂解法。可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提.

二、基本操作流程1、SDS①收集或提取蛋白样品

②测定蛋白样品浓度一般来说有三种方法：第一种是采用定量试剂盒；第二种是采用光学检测法；第三种直接跑SDS。二、基本操作流程1、SDS①收集或提取蛋白样品②测定蛋白样品浓度

③电泳配制SDS凝胶，在收集的蛋白样品中加入上样缓冲液，点样后接通电源开始电泳。利用浓缩效应、分子筛效应和电荷效应将不同分子量大小的蛋白质分离。二、基本操作流程1、SDS①收集或提取蛋白样品②测定蛋白样品浓度③电泳

④电泳结果检查考马斯亮蓝使用简便快速，是最经济通用的蛋白PAGE胶电泳染色方法。银染操作复杂一些但分辨率高很多。可是由于考马斯亮蓝染色或者银染经过固定不可逆结合，会干扰后面的WesternBlot实验，很多人会选择省略掉这一步。同样的样品跑2块胶，一块染色一块转膜，一般也可以说明问题。二、基本操作流程2、抗原转移通常有两种方法：毛细管印迹法（转移效率较低）和电泳印迹法（常用）。

电泳印迹法用有空的塑料盒有机玻璃板将凝胶和硝酸纤维素膜夹成“三明治”状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质离开凝胶结合在硝酸纤维素膜上。二、基本操作流程2、抗原转移2、抗原转移

转移膜的选择WesternBlot印迹常用的转移膜主要是硝酸纤维素膜（NC）和偏二氟乙烯(PVDF膜），此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。膜的选择根据：a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）；b.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；c.如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。二、基本操作流程2、抗原转移

NC膜简介硝酸纤维素膜是蛋白印迹最广泛使用的转移介质，其优点是对蛋白有结合能力强，适用于各种显色方法（包括同位素，化学发光、常规显色、染色和荧光显色），背景低，性价比高；使用也很简便（不需要甲醛预处理，只须在无离子水面浸润排出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡；而且容易封闭，也不需要特别严谨的清洗条件）。转移到NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间。

二、基本操作流程优2、抗原转移

NC膜简介但是纯的硝纤膜在比较脆，容易卷，不适合用于需要多次重复清洗的用途。选择硝纤膜时要注意的是选择合适的孔径，通常20KD以上的大分子蛋白用孔径的膜，小于20KD的话建议选择的，如果小于7KD的话最好选择的膜。二、基本操作流程缺3、封闭电泳转移后，固相纸膜上还留有无蛋白组分结合的区域，在对蛋白质进行专一性检测的时候，由于免疫学检测试剂中的蛋白质（抗体），在与特异性抗原结合的同时也会非特异的结合固相上的空白区域，产生高背景，导致检测结果不明显，因此要对这些空白区域进行封闭。最常用的封闭剂就是脱脂奶粉。二、基本操作流程各种常见的封闭剂4、免疫检测把已经封闭过的膜放入加入已知抗体的缓冲液中，对特异性的靶抗原进行检测。这个过程通常会发生多步反应，一般采用间接检测法，常用的检测系统有放射性同位素、酶、荧光素等，通过放射自显影或显色反应检测抗原-抗体复合物，从而达到对蛋白质进行特异性检测和鉴别的目的。二、基本操作流程原理流程图三、注意事项1．免疫印迹技术所测定的只是目的蛋白的相对含量。因此不能确定一种细胞含有多少目的蛋白，只能确定该蛋白存在与否及其它条件下与其他细胞相比蛋白的含量是高还是低。2．比较一种目的蛋白在不同细胞或者同一细胞不同条件下的相对含量时，各样品的总蛋白量必须相等。3．选用合适的SDS胶浓度，使目的蛋白可以得到较好的分辨。4．开始电泳和转移膜时，一定要确认电极的正负极接头是否正确。5．在免疫检测中，要注意封闭非特异性结合位点。6．抗体反应在封口塑料袋内进行，一定要驱除袋内的所有气泡，否则会导致抗体结合不均匀。7．操作要轻柔，带手套，不要再转移膜上造成任何刮痕。在整个操作中，转移膜要始终在液体中，不能干燥。三、注意事项四、Western-blotting的应用

（3个例子）目前，Western印迹法主要用于未知蛋白质的检测及抗原组分、抗原决定簇的分子生物学的测定；同时也可用于未知抗体的检测和单克隆抗体的鉴定等。很多疾病在不同的发病阶段，即使临床上还没有明显的症状，在蛋白质水平就发生了变化，这些变化有可能成为临床早期的诊断指标。免疫印迹可以用于疾病的早期诊断和预后的跟踪分析检测。艾滋病的确诊检测（例1）艾滋病的临床症状持续发热、乏力、腹泻、食欲不振、体重下降、夜间盗汗、全身淋巴结肿大、精神抑郁、表情淡漠呈慢性病容，以及由于机体抵抗力低下，出现一些不常见的条件致病菌感染或机会感染性疾病的症状。四、Western-blotting的应用艾滋病的诊断标准艾滋病病毒抗体阳性，又具有下述任何一项者，可为实验确诊艾滋病病人。1)近期内(3—6个月)体重减轻10%以上，且持续发热38℃达1个月以上。2)近期内(3—6个月)体重减轻10%以上，且持续腹泻(每日3—5次)1个月以上。3)卡氏肺囊虫肺炎(P.C.P)。4)卡波西肉瘤(K.S.症状是胳膊上或者腿上出现紫色斑块)。5)明显的霉菌或其它条件致病菌感染。四、Western-blotting的应用大鼠出生前后心肌端粒酶逆转录酶表达的变化（例2）

目的：探讨大鼠心肌组织端粒酶逆转录酶的发育规律。方法：免疫组织化学和免疫印迹技术检测SD大鼠心肌端粒酶逆转录酶（TERT）的表达，图像分析技术对心肌组织TERT的表达进行定量分析。结果：3组大鼠心肌组织中的心肌细胞、平滑肌和内皮细胞均有TERT的表达。TERT主要位于细胞质和细胞核内。TERT的总表达规律是20d胎鼠阳性表达强于出生后6d大鼠，出生后12d大鼠心肌表达最低，3组之间TERT的组间比较差异有统计学意义。结论：大鼠心肌组织的端粒酶活性随着日龄增加，其表达逐渐减少。四、Western-blotting的应用蛋白质免疫印迹技术检测肺癌组织上皮钙粘蛋白的表达（例3）目的：探讨上皮钙粘蛋白(E-cad)与肺癌及其病理类型之间的相关性.方法：应用蛋白质免疫印迹技术检测30例肺癌患者的癌、癌旁和远癌肺组织及5例肺良性对照标本中E-cad的表达,并对部分表达阴性的标本用免疫组化方法进行验证.结果：癌组织、癌旁组织、远癌组织E-cad的阳性率分别为36.7%、70.O%、96.7%.癌组织阳性率明显低于癌旁组织，也明显低于远癌组织；癌旁组织E-cad阳性率明显低于远癌组织。在30例肺癌患者鳞癌、腺癌及腺鳞癌的癌组织中E-cad阳性率分别为33.3%、40.O%、33.3%;鳞癌、腺癌及