第9章 生物芯片

第九章生物芯片biochip2/1/2023海南大学农学院wss12/1/202322/1/202332/1/202342/1/20235何为生物芯片？生物芯片是通过平面微细加工技术在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系统，以实现对细胞、蛋白、核酸以及其他生物组分的准确、快捷、大信息量的检测。生物芯片包括2/1/20236生物芯片的分类

2/1/20237根据用途还可以把生物芯片分为两类：信息生物芯片（information-biochip）和功能生物芯片（function-biochip）。2/1/20238生物芯片分析过程试样处理点阵固定反应或杂交芯片制作标记洗涤检测扫描光刻合成微量点样喷墨纯化、标记光化学检测电化学检测计算处理2/1/20239内容提要第一节 基因芯片第二节 蛋白质芯片第三节 芯片实验室2/1/202310基因芯片技术的概念基因芯片(Genechip)技术是指通过微阵列(Microarray)技术将高密度DNA片段阵列通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。基因芯片又称DNA芯片。第一节基因芯片2/1/202311基因研究的前沿技术-----基因芯片技术测序类基因芯片类PCR类2/1/202312基因芯片发展历史Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray2/1/202313DNA芯片的主要类型按制备方式分：原位合成芯片：采用显微光蚀刻等技术在特定部位原位合成寡核苷酸(ONA)而制备的芯片。合成的序列较短cDNA微集阵列：将通过mRNA制备的（cDNA)片段以显微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片(CDA)。固定基因的来源较灵活2/1/202314按探针分类：DNA芯片寡核苷酸阵列（芯片）基因组芯片cDNA芯片2/1/202315一、基本原理基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交方法（southern

、northern）相似。核酸印迹：将待测样品DNA（靶基因）固定于支持物上，用已知序列DNA片段制作探针，二者按碱基互补配对原理杂交，检测出欲鉴定的基因。基因芯片：将大量已知基因片段（与核酸印迹相反）以微阵列方式固定在支持物上，待测样品用荧光染料标记制成探针，当探针与芯片上的靶基因杂交后，通过随后的信号检测进行定性与定量分析。基因芯片在一微小的基片表面集成了大量的DNA分子，能够在同一时间内平行分析大量的基因，进行大信息量的筛选与检测分析。2/1/202316二、基因芯片的制作DNA芯片技术流程图芯片制作样品的制备显微光蚀刻压电打印分子打印原位合成芯片固定基因设计与制备支持物预处理打印固化DNA微集阵列样品核酸的提取与纯化扩增与标记标记样品的纯化杂交及杂交后清洗扫描与分析2/1/202317基因芯片技术流程

1.芯片制备-目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或cDNA按顺序排列在载体上。芯片的制备除了用到微加工工艺外，还需要使用机器人技术。以便能快速、准确地将探针放置到芯片上的指定位置。

2.样品制备-生物样品往往是复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应，有时样品的量很小。所以，必须将样品进行提取、扩增，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。2/1/202318

3.杂交反应-杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的DNA片段进行的反应,产生一系列信息的过程。选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配率。

4.信号检测和结果分析-杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以分析图像，将荧光转换成数据，即可以获得有关生物信息。2/1/202319基因芯片的基本要素固相介质有硅片、二氧化硅、玻璃、尼龙膜、塑料等。靶片段

DNA、寡核苷酸、RNA等。探针

mRNA，或是以mRNA为模板合成的cDNA。标记物常采用荧光剂，如Cy3、Cy5，

同位素、地高辛等。2/1/202320

1.支持物的预处理（略）

2.制作DNA芯片(1)原位合成芯片的制备

A.光引导原位聚合技术：支持物表面活性基团连接有光敏保护基团（X）受到保护。

优点：合成效率高，点阵密度高；

缺点：设备昂贵，技术复杂，反应产率低。(一)芯片的制备2/1/202321原位合成(InSituSynthesis)2/1/202322B.压电打印法：压电毛细管喷射器

优点：设备廉价，技术相对简单，反应产率高。

缺点：点阵密度低，易产生交叉污染。2/1/202323(2)DNA微集阵列的制备方式：预先合成寡聚核苷酸、cDNA或DNA基因组通过高速点样打印到芯片上。A.DNA片段的制备已克隆的基因片段PCR，RT-PCR扩增的基因片段人工合成的DNA片段单链、双链、DNA或RNA均可2/1/202324B.打印喷墨打印（非接触式点样）优点、缺点针式打印（接触式点样）优点、缺点2/1/202325点阵芯片的制作技术2/1/202326DNA点阵芯片2/1/202327C.固化打印DNA片段后，需要将其固定在支持物表面，同时也要封闭支持物上未打印区域以防止核酸样品的非特异性固定。2/1/202328(二)测定样品的准备1.样品的分离纯化DNA,mRNA2.扩增PCR,RT—PCR，固相PCR3.标记等过程荧光标记（常用Cy3、Cy5），生物素,放射性标记4.标记后样品的纯化2/1/20232916economicalandsensitiviefluorescentdyealternativesscannedwithScanArray5000.多种荧光染料2/1/202330(三)分子杂交样品与DNA芯片上的阵列进行杂交。与经典分子杂交的区别：杂交时间短，30分钟内完成；可同时平行检测许多基因序列。影响杂交反应的因素：盐浓度、温度、反应时间、DNA二级结构2/1/202331芯

片

合

成

程

序2/1/202332(四)检测分析激光激发使含荧光标记的DNA片段发射荧光激光扫描仪或激光共聚焦显微镜采集各杂交点的信号软件进行进行图象分析和数据处理2/1/202333芯片信息采集：荧光标记双波长扫描激光激发光源共聚焦扫描计算机处理2/1/202334ScanArray

Lite

2/1/202335三、DNA芯片技术的应用2/1/2023海南大学农学院wss36（一）应用之一：基因表达谱（geneexpressionpattern)BiologicalSampleFunctionalInformation红色上调黄色不变绿色下调2/1/202337基因表达谱芯片应用最为广泛，技术上也最成熟。这种芯片可以检测整个基因组范围的众多基因在mRNA表达水平的变化。它能对来源于不同个体、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同生理病理、不同刺激条件下的组织细胞内基因表达情况进行对比分析。从而对基因群在个体特异性、组织特异性、发育特异性、分化特异性、疾病特异性、刺激特异性的变化特征和规律进行描述。2/1/202338进一步阐明基因的相互协同、抑制、互为因果等关系。有助于理解基因及其编码的蛋白质的生物学功能，并从已知生物学功能的基因推论未报道基因的生物学意义。同时，还可在基因水平上解释疾病的发病机理，为疾病诊断、药效跟踪、用药选择等提供有效手段。急性白血病、黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌等表达谱芯片的研究。2/1/202339应用举例：检测人正常肝细胞与肝癌细胞中差别表达的基因将4096条人cDNA制备成表达芯片。（1500条为已知基因，2548未知，16个阴性对照基因，32个空白点。）提取人正常肝和肝癌组织mRNA，逆转录成cDNA。将Cy3和Cy5荧光分别标记到两种来源的cDNA。与芯片杂交、扫描。计算机数据处理，判断差别表达的基因。标准：1、Cy3与Cy5表达差别>2。

2、Cy3或Cy5信号值>1000。2/1/202340（二）DNA测序：杂交测序（SBH）TCGGATCGCGGATCGAGGATCGACGATCGACTATCGACTTTCGGATCGCGGATCGAGGATCGACGATCGACTATCGACTTTCGGATCGACTTAGCCTAGCTGAA65536个八核苷酸阵列2/1/202341生物芯片能为现代医学科学及医学诊断学的发展提供强有力的手段，促进医学从“系统、血管、组织和细胞层次”(通常称之为“第二阶段医学”)向“DNA、RNA、蛋白质及其相互作用层次”(第三阶段医学)过渡，使之快速进入实际应用。（三）临床诊断2/1/202342（四）基因诊断：寻找和检测与疾病相关的基因及在RNA水平上检测致病基因的表达（五）药物研究与开发：

1.药物筛选

2.合理用药

3.中草药鉴定（六）癌症研究2/1/202343基因芯片的优点：高通量大规模高度平行性快速高效高灵敏度高度自动化2/1/202344基因芯片的缺点

基因芯片的缺点在于其不能对待检测基因在多细胞类型组织中的精确定位进行判断。另外很多蛋白质调节其功能不主要是依赖其是否表达或表达量高低，而是依赖蛋白质磷酸化-去磷酸化等方式。在这种情况下，用核酸类生物芯片就没有什么意义了，正在研究开发中的蛋白类芯片可能会有所作为的。

2/1/202345内容提要第一节 基因芯片第二节 蛋白质芯片第三节 芯片实验室2/1/202346固定于载体上的蛋白质样品（靶蛋白）以阵列方式构成，待测样品用荧光染料或同位素标记制备成探针与芯片杂交，杂交信号用激光扫描仪或放射自显影检测及计算机分析检测结果。蛋白质芯片适合于蛋白质－蛋白质、蛋白质－核酸（DNA、RNA）、蛋白质－小分子之间的相互作用分析；适合功能基因组、蛋白组研究。第二节蛋白质芯片2/1/202347一、蛋白质芯片特点蛋白质不能用扩增方法提高拷贝数来达到要求的灵敏度；蛋白质与蛋白质间的特异作用主要是抗原－抗体或配体－受体的反应；反应的实质是专一性，而非序列的特异性。2/1/202348二、蛋白组研究动态双向电泳蛋白质芯片双链DNA芯片与相关蛋白质的作用2/1/202349三、制备蛋白质芯片蛋白质分子以共价结合方式固定于玻片固定封阻醛基化（适合蛋白质分子）共价结合法：BSA-羟基琥珀酰化（适合多肽、小分子蛋白）2/1/202350四、制备蛋白质探针待测蛋白质样品经荧光染料、生物素等标记，制成探针。荧光染料：荧光素、罗丹明、德克萨斯红等；生物素标记：偶联法标记抗体、标记蛋白质；金标记：以金粒的电子密度大的特点，与抗体偶联，经特异性的反应，通过电子显微镜观察胶体金颗粒，显示细胞、组织反应的实质即部位。2/1/202351五、蛋白质芯片应用1.蛋白质－蛋白质相互作用检测图谱；2.酶－底物相互作用，分析酶的化学及酶的反应动力学；3.分析基因表达与筛选抗体；4.建立蛋白质谱，诊断疾病，直接采患者的血清或体液进行快速诊断。2/1/202352双链DNA芯片与相关蛋白质的作用DNA的转录的起始或终止都与