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文档简介

一种参环毛蚓肠上皮细胞系及其建立方法技术领域本发明涉及未分化的非人类细胞,具体涉及一种参环毛蚓肠上皮细胞系。背影技术参环毛蚓Pheretimaaspergillum(E.Perrier)来源于钜蚓科环毛蚓属,是《中华人民共和国药典》2010版“地龙”项下收载的4种原动物之一。因其主产于广东和广西两地,故被称为“广地龙”。由于广地龙疗效确切,药材加工精细讲究而被业内公认为品质最优。中药地龙在《中华人民共和国药典》收录品种还有栉盲环毛Pheretimapectinifera(Michaelsen)、威廉环毛蚓Pheretimaguillelmi(Michaelsen)以及通俗环毛蚓Pheretimavulgaris(Chen)的干燥体,后三种习称“沪地龙”。地龙性寒、味咸,归肝、脾、膀胱经,具有清热息风、通经络、平喘、利尿之功。主治高热惊痫,气虚两滞,半身不遂,肺热哮喘,小便不利及热痹等症。近20年来,国内外有关地龙的化学成分、药理作用、临床应用的研究报道相对较多。大量研究表明,地龙不仅含有丰富的营养成分,还含有多种药理活性成分,其药理作用几乎涉及人体各个系统,主要有降压、抗血栓、抗心律失常、抗癌、增强免疫、抗溃疡、解热镇痛、镇静、平喘、抗菌等作用。由此可见,地龙不论作为药品还是营养保健品开发利用,在经济、社会和生态方面都有巨大的效益潜力。目前地龙药材大多仍靠野生资源,加上不同环境条件以及采收加工技术等的影响,造成药材质量极不稳定,特别是重金属超标一直难以控制的问题。近年,在国家科技部“十五”国家重大科技攻关项目“广地龙规范化养殖研究”的资助下,我们曾随机抽取12批在我国市场上销售的广地龙药材进行了重金属含量调查,由中国广州分析测试中心的检测报告(编号2004093019)表明:其中7批次的镉(Cd2+)含量超过中华人民共和国对外贸易经济合作部发布的《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》中规定的限量,其超过的倍数从23倍至143倍不等。由此可见,市场上广地龙重金属超标问题令人堪忧,已严重制约其出口量和临床用药安全。为进一步深化参环毛蚓的重金属富集机制,制定降低或消除广地龙重金属超标的研究,建立参环毛蚓的细胞系是至关重要的一个环节,目前关于蚯蚓细胞培养报道并不多,还存在大量空白,仅涉及到的品种是正蚓科Lumbricidae的陆正蚓Lumbricusterrestis和赤子爱胜蚓Eiseniafoetida,且为70年代和90年代的初步尝试,距今时间较久,研究进展方面见到零星报道。《广州中医药大学学报》2011年5月第28卷第3期刊载了题为“参环毛蚓细胞原代培养灭菌方法的研究”一文,该文所公开的参环毛蚓细胞原代培养灭菌方法虽然也是常见的动物细胞培养方法,但是在培养过程及后续的观察中发现其存在细胞传代时分裂增长慢,且容易出现早期细胞凋亡的缺陷。发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种改进的参环毛蚓肠上皮细胞系,该细胞系不仅长时间保藏成活率高,而且在传代培养时仍然表现出快速分裂增长的活性。本发明解决上述问题的技术解决方案是:一种参环毛蚓肠上皮细胞系,其特征在于,其保藏号为CCTCC—C201294。上述参环毛蚓肠上皮细胞系的建立方法由以下步骤组成:将收集野外采集的参环毛蚓置于实验室泥土(温度28°C、PH=4.5、土壤含水量21.5%)中,用蒸馏水养殖2周后,置于垫有用蒸馏水湿润的滤纸的烧杯中,保持适宜的温度28C,湿度60%,每天换滤纸1次,吐泥3〜4天;取吐泥3〜4天后的参环毛蚓于超净台上,用75%酒精体表消毒后解剖,将获得的肠道部位用LBSS缓冲液冲洗,再用抗生素组合液灭菌2〜3min;弃抗生素组合液得到的肠道部分先加入体积为肠道体积的10倍的Thermolysin酶解液酶解20min后弃去酶解液,再加入体积为肠道体积的10倍的CollagenaseTypeI酶解液酶解20分钟,过100目的细胞篩除去较大的组织碎片,然后以1000r/min离心5min,弃上清,收集细胞;其中,所述的抗生素组合液是将青霉素钠、硫酸链霉素和硫酸庆大霉素加入到LBSS溶液混合制成的,所制得的抗生素组合液中,青霉素钠的浓度为200U/ml,硫酸链霉素的浓度为400pg/ml,硫酸庆大霉素的浓度为300U/ml,两性霉素B的浓度为5pg/ml;所述的Thermolysin酶解液是将Thermolysin粉末加入到浓度为10mmol/ml的HEPES溶液中过滤灭菌混合制成,所制得的Thermolysin酶解液中Thermolysin的浓度为25“g/mL所述的CollagenaseTypeI的酶解液是将CollagenaseTypeI粉末加入到不含Ca2+、Mg2+的HBSS(1x)溶液中过滤灭菌而成,所制的CollagenaseTypeI酶解液中CollagenaseTypeI的浓度为0.2mg/mL;往收集的细胞中加入培养液调整细胞密度为1x105/ml接种于透气培养瓶中,置于28C,5%CO2培养箱中培养,同时,观察细胞生长情况,当细胞贴壁面积达到80%时,吸去细胞培养液,用LBSS冲洗1〜2遍;如果培养到第五天细胞贴壁面积还达到80%,便进行半量更换液培养液继续培养;其中所述的培养液由91.55%的F12DMEM、5%的FBS、1%的EGF溶液、1%的insulin试剂、0.75%的浓度为40000U/ml的硫酸庆大霉素、0.2%的青霉素钠试剂、0.4%的硫酸链霉素试剂、0.1%的两性霉素B试剂组成,其中,所述的EGF溶液是把EGF粉末加入到的浓度为10mmol/ml的HEPES缓冲溶液中制成,所制得的EGF溶液中EGF的浓度为2000ng/ml;所述的insulin试剂是把insulin粉末加入到F12DMEM中制成,所得到insulin试剂中insulin的浓度为200》g/ml;所述的青霉素钠试剂是将青霉素钠溶解到LBSS中制成,其中青霉素钠在试剂的浓度为100000U/ml;所述的硫酸链霉素试剂是将硫酸链霉素溶解到LBSS中制成,其中硫酸链霉素在试剂中的浓度为800000》g/ml;所述的两性霉素B试剂是将两性霉素B溶解到DMSO中制成,其中两性霉素B在试剂中的浓度为5000》g/ml;然后,刮下上皮样细胞克隆区域以外的细胞群,再往培养瓶加入传代培养液淹没贴壁面的细胞继续培养,直到上皮样细胞克隆区域达到85%以上,即得到所述的参环毛蚓肠上皮细胞系;其中所述的传代培养液是由体积百分比为91.5%的F12DMEM、5%的FBS、1%的浓度为2000ng/mlEGF溶液;1%的浓度为200胆/mlinsulin试剂;1.45%青霉素-链霉素溶液(1x),其中,所述的EGF溶液是把EGF粉末加入到的浓度为10mmol/ml的HEPES缓冲溶液中制成,所制得的EGF溶液中EGF的浓度为2000ng/ml;所述的insulin试剂是把insulin粉末加入到F12DMEM中制成,所得到insulin试剂中insulin的浓度为200》g/ml。由于本发明所述的参环毛蚓肠上皮细胞系的构建方法在现有技术的基础上作了较大的改进,尤其是抗生素组合液、酶解液和培养液进行大幅度的改良,附图说明图1(a)是本发明的广地龙形态图图1(b)是本发明的参环毛蚓肠上皮隐窝样单位图1(c)是本发明的参环毛蚓原代肠细胞200倍图1(d)是本发明的参环毛蚓肠上皮样细胞克隆200倍图2(a)是本发明的参环毛蚓肠上皮细胞生长曲线图3(a)是本发明的参环毛蚓肠上皮细胞PCR检测图图4(a)是本发明的参环毛蚓肠上皮细胞CAKP染液的阳性400倍图4(b)是本发明的参环毛蚓肠上皮细胞CAKP染液的阳性2000倍图4(c)是本发明的参环毛蚓肠细胞CAKP染液的阳性和阳性1000倍图5(a)是本发明的参环毛蚓肠上皮细胞SOD酶鉴定图图5(b)是本发明的参环毛蚓肠上皮细胞MDH酶鉴定图图5(c)是本发明的参环毛蚓肠上皮细胞考马斯亮蓝鉴定图具体实施方式本发明提供了一种参环毛蚓肠上皮细胞系的建立方法,该方法包括以下步骤:1、参环毛蚓肠细胞的原代分离培养,确立提取细胞的最佳原动物生长期:1)收集野外采集样品后,置于实验室泥土中,用蒸馏水养殖2周以上,然后取活体置于烧杯吐泥3〜4d,测量参环毛蚓湿重详细记录,取样品活体于超净台上,用75%酒精体表消毒后解剖。将样品的肠道解剖分离,然后用LBSS缓冲液冲洗多次,然后用抗生素组合液灭菌2〜3min。2)将已灭菌的各部分组织移入无菌培养皿中切细成约1mm3小块,置于离心管中,添加3〜5mL联合酶酶解30min(酶液必须浸过组织块)。3)用100目细胞篩过滤,并用LBSS多次冲洗滤渣,以获得更多细胞,取其液体,转速1000r/min,离心5min,弃去上清液,加入培养基终止酶解。再次离心,弃去上清液,收集细胞。该联合酶是25yg/mLThermolysin+0.2mg/mLCollagenaseTypeI。将收集的细胞沉淀物加入完全培养基轻轻吹打成均匀的细胞悬液,分别将细胞浓度调节至5x105个/ml后接种至培养瓶中,该培养液是F12DMEM+5%FBS+20ng/mlEGF+2yg/mlinsulin+200U/ml青霉素钠+400yg/ml硫酸链霉素+300U/ml硫酸庆大霉素+5yg/mL两性霉素B的培养液。2、 将分离培养的原代参环毛蚓肠细胞进行机械分离纯化:将酶解后的参环毛蚓肠细胞培养6天后,在倒置显微镜下观察细胞生长情况,并记录原代细胞培养贴壁时间及贴壁面积7天后观察细胞生长情况,并半量换液。待细胞出现上皮样细胞克隆和肌肉细胞克隆,用机械分离法进行分选:1)用倒置显微镜下用笔在培养皿上标记出上皮样细胞克隆区域;2)吸去培养液,用LBSS洗1〜2遍;3)用消毒过的细胞刮刀将上皮样以外区域刮掉,然后补加培养液,继续培养。4)重复上面第3)步,如此反复,直到获得上皮样细胞克隆。3、 检测并进行扩大培养,建立参环毛蚓肠上皮细胞系。具体实现方式是:1)待细胞长至融合时,弃去培养液,用0.125%胰蛋白酶+0.01%EDTA消化液在37°C条件下消化lmin左右,弃上清液。然后加0.1mg/mLDispaseI+300U/mLCollagenaseTypeXI消化;2)等量细胞培养液终止消化,将经过消化的参环毛蚓肠上皮细胞在1000r/min,离心5min;3)弃上清,计数,调整细胞浓度5x105个/ml将细胞悬液接种到培养皿上,加细胞培养液;4)连续培养6〜8代后,肌肉细胞逐渐减少消失,80%以上表现为上皮样细胞,细胞大量扩增,即建立成参环毛蚓肠上皮细胞系参见图1,用以上方法获得的参环毛蚓肠上皮细胞,并稳定传到9代,细胞形态没有发生改变。对分离培养的参环毛蚓肠上皮细胞进一步检测方法:1、 群体倍增时间的测定及细胞周期的检测,测得参环毛蚓肠细胞的生长曲线。具有方法是:取p4代细胞,消化制成细胞悬液,接种于96孔板,每天抽取一板在酶标仪上,490nm波长,测其吸光度OD,计算平均值,绘制生长曲线。参见图2,细胞潜伏期1〜3天,细胞群倍增时间为7d,衰退时间13d,2、 取p5代细胞,消化制成细胞悬液,提取细胞基因组DNA,利用COI基因的通用引物进行PCR扩增,PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶中用GV染色进行检测扩增效果,PCR产物进行纯化后委托测序公司进行双向测序。测得的序列与NCBI数据库中的序列进行比对,序列较为吻合,鉴定为钜蚓科环毛蚓属Pheretimaaspergillum(E.Perrier)。PCR引物序列 引物 核苷酸序列P1 5'-GGTCAACAAATCATAAGATATTGG-3'P2 5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'PT-PCR反应体系如下:10XPCRBuffer(含15mMMgCl2)5gl模板DNA(20-50ng/yl)2glMgCl2(25mM)4gl引物1(IpM)2gl引物2(1pM)2gldNTPs(10mMeach)1glTaq酶(1U/yl)1glddH2033glPCR的反应条件为:①:94C预变性4min;②:94C变性45s;③:49C退火40s;④:72C延伸1.5min;⑤:②-④30个循环;⑥:72C终延伸7min。之后于4°C保存。参见图3(a)细胞提取的PCR产物其大小在650bp左右,其条带清晰明亮,无拖尾。3、取p5代细胞消化制成悬液,离心收集细胞,用PBS冲洗1〜2遍,冰浴提取细胞蛋白,-80°C保存备用,作为同工酶点样样品。同工酶聚丙酰胺凝胶制备分离胶制备体积(V)浓缩胶胶制备体积(V)ddHO28.2mlddHO26.0ml30%Arc-Bis10ml30%Arc-Bis1.5ml分离缓冲液6.3ml浓缩缓冲液1.5ml10%AP0.25ml10%AP0.1mlTEMED原液0.0

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