第11章色谱分析法概论

1第十一章

色谱分析法概论

Chromatography《分析化学下册》课程进样空气峰t信号2

色谱法的概述色谱法的基础知识色谱分离的基本理论色谱法的发展趋势主要内容31906年俄国植物学家茨维特（M.Tswett）从分离植物色素实验中发明了色谱分离方法。俄国植物学家茨维特11.1概述1906，俄国植物学家M.Tswett发明色谱法，是色谱之父。1931，对液固吸附色谱的杰出贡献者库恩，分离出60多种胡萝卜素，核黄素、维生素，获1938年诺贝尔化学奖。蒂塞利乌斯（Tiselius）因电泳分析方法的研究，发现血清蛋白组分，获1948年诺贝尔化学奖。1941，马丁（Martin）和辛格（Synge）创始分配色谱特别是纸色谱而共获1952年诺贝尔化学奖。氨基酸自动分析仪发明人S·穆尔（StanfordMoore）和W.H.斯坦（WilliamHowardStein)，定量分析方法解决了有关氨基酸、多肽、蛋白质等复杂的生物化学问题，获1972年诺贝尔化学奖。45611.2色谱法的基本知识色谱过程：实现色谱操作的基本条件是必须具备相对运动的两相，固定相(stationaryphase)和流动相(mobilephase)。色谱过程是组分的分子在流动相和固定相间多次“分配”的过程。组分的结构和性质微小差异与固定相作用差异随流动相移动的速度不等差速迁移色谱分离。BAABBABBABABct流动相样品液色谱柱固定相检测器7色谱的基本术语：1.色谱的流出曲线色谱流出曲线：是由检测器输出的电信号强度对时间作图所绘制的曲线，又称为色谱图。基线：是在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线。基线反映仪器(主要是检测器)的噪音随时间的变化。峰高

(h)：组分在柱后出现浓度极大时的检测信号，即色谱峰顶至基线的距离。峰宽

(W)：色谱峰的宽度取决于组分在柱中迁移扩散程度。8标准差(σ)：正态色谱流出曲线上两拐点间距离之半，即0.607倍峰高处的峰宽之半。σ的大小表示组分被带出色谱柱的分散程度。σ越大，组分越分散；反之越集中。峰宽

(W)：色谱峰两侧拐点作切线在基线上所截得的距离。

W=4σ半峰宽

(W1/2)：峰高一半处的峰宽W1/2=2.355σ；W=1.699W1/2三种描述方法：92.保留值保留时间(tR)：从进样到某组分在柱后出现浓度极大时的时间间隔。死时间

(t0)：分配系数为零的组分，即不被固定相吸附或溶解的组分的保留时间。调整保留时间

()：某组分由于溶解（或被吸附）于固定相，比不溶解（或不被吸附）的组分在柱中多停留的时间。10保留体积(VR)：从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大时，所需通过色谱柱的流动相体积。死体积(V0)：由进样器至检测器的流路中未被固定相占有的空间。固定相颗粒间间隙、导管的容积、检测器内腔容积的总和。调整保留体积（）：由保留体积扣除死体积后的体积。

注意：VR’是定值，tR’与FC成反比113.相对保留值相对保留值(r)：两组分的调整保留值之比。保留指数(I)

：用保留时间紧邻待测组分的两个正构烷烃来标定组分的相对保留值，又称Kovats指数：Ix为待测组分的保留指数；z与z+n为正构烷烃对的碳原子数，n通常为1；规定正己烷、正庚烷及正辛烷为600、700及800。12例：在ApiezonL柱上，柱温100℃，用正庚烷及正辛烷为参考物质对，测得t0=30.0，正庚烷的tR=204.0，乙酸正丁酯的tR=340.0及正辛烷的tR=403.4。说明乙酸正丁酯在ApiezonL柱上的保留行为相当于7.756个碳原子的正构烷烃的保留行为。注意：烷烃类组分保留指数只与被测物质及色谱柱固定相、柱温有关，不受固定相用量、载气种类及流速等条件影响。Ix=100（）=775.6134.相平衡常数分配系数（distributioncoefficient；K）：是在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相(s)与流动相(m)中的浓度(C)之比。注意：分配系数仅与组分、固定相和流动相的性质及温度（和压力）有关。是组分的特征常数。保留因子（capacityfactor；k）：在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相和流动相中的质量(m)之比，称为质量分配系数或分配比。与固定相和流动相的体积有关。tR=t0(1+k)tR=t0(1+K

)145.分离参数分离度(resolution；R)：又称分辨率。是相邻两色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比。设正常峰，W1≈W2=4σ当R=1.5时，99.7%面积（tR±3σ）被分开，∆tR=6σ，称6σ分离。分离因子()：又称为分配系数比或选择性系数。15色谱法的分类：

1.按流动相的分子聚集状态分类: GC、LC、SFC等

2.按固定相的分子聚集状态分类: GSC、GLC、LSC、LLC等

3.按操作形式分类:

柱色谱法、平面色谱法、毛细管电泳法等

4.按色谱过程的分离机制分类:

分配色谱法、吸附色谱法、离子交换色谱法、空间排阻色谱法、亲合色谱法等161.按两相分子的聚集状态分类2.按固定相的固定方式分类柱色谱：填充柱、毛细管柱色谱平面色谱：纸色谱、薄层色谱

分配色谱：利用分配系数的不同吸附色谱：利用吸附性能的差异离子交换色谱：利用离子交换能力不同空间排阻色谱：利用排阻作用力的不同3.按分离的机制分类液相色谱：液-固色谱、液-液色谱气相色谱：气-固色谱、气-液色谱

色谱分类17色谱基本类型的分离机理：1.吸附色谱分离原理：利用被分离组分对固定相表面吸附中心吸附能力的差别而实现分离。吸附过程是试样中组分的分子(X)与流动相分子(Y)争夺吸附剂表面活性中心的过程，即为竞争吸附过程。吸附系数与吸附剂的活性、组分的性质和流动相的性质有关。图11-1

吸附色谱示意图.X.溶质分子；Y.流动相分子；a.吸附剂；m.流动相。18固定相：多为吸附剂，如硅胶、氧化铝。硅胶表面硅醇基为吸附中心。经典液相柱色谱和薄层色谱：一般硅胶高效液相色谱：球型或无定型全多孔硅胶和堆积硅珠。气相色谱：高分子多孔微球等流动相：有机溶剂（硅胶为吸附剂）洗脱能力：主要由其极性决定。强极性流动相占据吸附中心的能力强，洗脱能力强，使k值小，保留时间短。Snyder溶剂强度o：吸附自由能，表示洗脱能力。o值越大，固定相对溶剂的吸附能力越强，即洗脱能力越强。19洗脱顺序：

ka=KaSa/Vm

在色谱柱（Sa与Vm一定）时，Ka大的组分保留强，后被洗脱，Ka小的组分在吸附剂上保留弱，先被洗脱。

Ka与组分的性质（极性、取代基的类型和数目、构型有关）。以硅胶为吸附剂：极性强的组分吸附力强。①饱和碳氢化合物为非极性化合物，不被吸附。②基本母核相同，引入的取代基极性越强，则分子的极性越强，吸附能力越强；极性基团越多，分子极性越强(但要考虑其他因素的影响)。③不饱和化合物的吸附力强，双键数越多，吸附力越强。④分子中取代基的空间排列。20

一些溶剂在硅胶上的o值溶剂

溶剂强度（o）溶剂

溶剂强度（o）正戊烷0.00甲基特丁基醚0.48正己烷0.00醋酸乙酯0.48氯仿0.26乙腈0.52二氯甲烷0.40异丙醇0.60乙醚0.43甲醇0.70212.分配色谱法分离原理:利用被分离组分在固定相或流动相中的溶解度差别而实现分离。溶质分子在固定相中溶解度越大，或在流动相中溶解度越小，则K越大。在LLC中K主要与流动相的性质（种类与极性）有关；在GLC中K与固定相极性和柱温有关。

图11-2分配色谱示意图。Xm流动相中游离的组分分子Xs固定相中溶解的组分分子22固定相:

又称固定液（涂渍在惰性载体颗粒上的一薄层液体）；化学键合相（通过化学反应将各种有机基团键合到载体上形成的固定相）。流动相:

气液分配色谱法：气体，常为氢气或氮气。液液分配色谱法：与固定相不相溶的液体。

正相液液分配色谱：流动相的极性弱于固定相的极性。反相液液分配色谱：流动相的极性强于固定相的极性。洗脱顺序:由组分在固定相或流动相中溶解度的相对大小而决定。正相液液分配色谱：极性弱的组分后被洗脱。(库仑力和氢键力）反相液液分配色谱：极性强的组分先出柱。233、离子交换色谱法分离原理：利用被分离组分离子交换能力的差别而实现分离。分为阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法。

固定相和流动相：固定相：离子交换剂（离子交换树脂、化学键合离子交换剂）。

流动相：一定pH和离子强度的缓冲溶液。影响保留行为的因素：受被分离离子、离子交换剂、流动相的性质影响。m21R图11-3离子交换色谱示意图1.固定离子；2.可交换离子R.树脂骨架；m.流动相244、分子排阻色谱法（MEC）分离原理：根据被分离组分分子的线团尺寸进行分离。也称为凝胶色谱法。根据空间排阻（stericexclusion）理论，孔内外同等大小的溶质分子处于扩散平衡状态：渗透系数：Kp=Xs/Xm

（0＜Kp＜1

）由溶质分子的线团尺寸和凝胶孔隙的大小所决定。在一定分子线团尺寸范围内，Kp与分子量相关，即组分按分子量的大小分离。分子排阻色谱示意图Ge.凝胶；m.流动相Gem大分子流动相凝胶孔隙25固定相：多孔凝胶：软质、半软质和硬质。主要性能参数：

平均孔径：

排斥极限（Kp=0）：不能渗透进入凝胶的任何孔隙最低分子量

分子量范围：排斥极限（Kp=0）与全渗透点（Kp=1）之间的分子量范围。选择凝胶时应使试样的分子量落入此范围。流动相:

要求：能溶解试样、润湿凝胶，粘度要低。水溶性试样选择水溶液为流动相（称为凝胶过滤色谱gelfiltrationchromatography；GFC）；非水溶性试样选择四氢呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有机溶剂为流动相（凝胶渗透色谱gelpermeationchromatography；GPC）。26小结色谱过程方程式：分配系数大的组分保留时间长（保留体积大），晚流出色谱柱。K在分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱和凝胶色谱中，分别为狭义分配系数K、吸附系数Ka、选择性系数KA/B和渗透系数Kp，Vs分别为色谱柱（或薄层板）内固定液体积、吸附剂表面积、离子交换剂总交换容量和凝胶孔内总容积。2711.3色谱法基本理论

色谱理论包括两方面:热力学理论：研究分配(分离)过程，塔板理论（platetheory）。动力学理论：研究各种动力学因素对峰展宽的影响，速率理论（ratetheory）。要使R大，必须：

1、∆tR大---∆k大----热力学

2、W小---峰展宽小---动力学1、

影响保留行为的因素推导色谱过程方程：在实验条件一定时，固定相和流动相的选择和体积都是确定的，故tR取决于K，也就是取决于组分的性质，所以保留时间是对组分进行色谱定性的指标。Vs固定相的体积Vm流动相的体积K↑,tR↑,组分后出柱K＝0，组分不保留K→∞，组分完全保留2、

等温线在一定温度条件下，组分在固定相和流动相的分配达到平衡时，在两相中的浓度之比值K为常数，由此绘制出的cs与cm的关系曲线，称为等温线。bccscmtRb前延峰a正常峰c拖尾峰aWh/2h0.05hW0.05hAB对称因子/拖尾因子完全对：fs=1.00对称峰：fs=0.95~1.05前延峰：fs＜0.95(A＞B)拖尾峰：fs＞1.05(A＜B)303、塔板理论

始于马丁（Martin）和辛格（Synge）提出的塔板模型。分馏塔：在塔板上多次气液平衡，按沸点不同而分离。色谱柱：组分在两相间的多次分配平衡，按分配系数不同而分离。塔板理论假定：①在色谱柱内每一“塔板”H内，组分在两相间瞬间达到分配平衡。②流动相间歇式进入色谱柱，每次进入一个塔板体积。③分配系数在各塔板内是常数。④纵向扩散可以忽略。31（一）质量分配和转移

1、单一组分B（kB=0.5）的分配和转移

①设色谱柱的塔板数n=5，即r=0、1、2、3、4（或n-1）号。 ②将单位质量的B加到第0号塔板上。 ③分配平衡后，0号塔板内ms/mm＝0.333/0.667。 ④进入一个塔板体积的流动相（一次转移）。32

组分B(kB=0.5)在n=5的色谱柱内及出口的分布

Nr01234柱出口

010000010.3330.667000020.1110.4440.44500030.0370.2220.4440.2960040.0120.0990.2690.3950.1980

50.0040.0410.1640.3290.3290.132

60.0010.0160.0820.2190.3290.219

700.0060.0380.1280.2560.219800.0020.0170.0680.1700.1709000.0070.0330.1020.11410000.0020.0160.0560.06833

组分A(kA=1)在色谱柱内和出口的分布

nr01234柱出口

010000010.50.5000020.250.50.2500030.1250.3750.3750.1250040.0630.2500.3750.2500.0630

50.0320.1570.3130.3130.1570.03260.0160.0950.2350.3130.2350.07970.0080.0560.1650.2740.2740.118

80.0040.0320.1110.2200.2740.137

90.0020.0180.0720.1660.2470.137100.0010.0100.0450.0940.2070.1242、两组分的分离A(kA=1)和B(kB=0.5)两组分34结果：

组分B:k=0.5,当n=6和7时，柱出口产生B的浓度最大点。组分A：k=1，n=8和9时，柱出口处达到浓度最大点。两组分开始分离，k小的组分B在柱后先出现浓度极大值,即先出柱。一根色谱柱n=103以上，组分有微小的分配系数(容量因子)差别即可实现完全分离。分配系数(容量因子)不等是分离的前提。注意：1、柱出口处的质量分数的计算。2、质量（浓度）最大点的N，即保留体积。35

(二)流出曲线

以组分A在柱出口处的质量分数对n作图。N柱出口

0010203040

5

0.03260.07970.118

80.13790.137100.124

k=1的组分从色谱柱中的流出曲线图当塔板数很大时，流出曲线趋于正态分布曲线。36(三)塔板高度和塔板数是色谱柱效参数。理解：在tR一定时，W(W1/2)

越小，N越大，H越小，色谱柱的分离效率越高。因此，理论塔板数是评价柱效能的指标。37优点：塔板理论是半经验性理论，在解释流出曲线的形状、浓度极大点的位置、评价柱效高低等方面是成功的。局限：塔板理论的基本假设与事实不完全相符，它无法解释谱带扩展的原因，也无法解释色谱过程与流动相流速、柱内分子扩散传质过程以及色谱操作参数等动力学因素的关系。这些问题，在速率理论中得到了圆满的解决。384、速率理论塔板理论的不足：

1.组分在两相中不可能真正达到分配平衡；

2.组分在色谱柱中的纵向扩散不能忽略;3.没有考虑各种动力学因素对传质过程的响；

4.无法解释柱效与流动相流速的关系；

5.不能说明影响柱效有哪些主要因素。

1956年，荷兰学者范第姆特(VanDeemter)提出了色谱过程动力学理论——速率理论。塔板高度涡流扩散项纵向扩散项传质阻抗项H=A

+B/u+Cu39符号名称单位H塔板高度cmA涡流扩散项cmB纵向扩散系数cm2·s-1C传质阻力系数su载气线流速cm·s-1图11-6范氏方程中各项对板高的贡献VanDeemter方程方程中各项的意义符号名称关系式备注A涡流扩散项(多路径项)A=2λdpdp固定相颗粒平均直径；λ涡流扩散因子，与填充的均匀性有关B/u纵向扩散项(分子扩散项)B=2rDgr

曲折因子，反映固定相颗粒的空间结构。填充柱r＝0.5-0.7,空心柱r＝1；Dg组分分子在载气中的扩散系数Cgu气相传质阻力项k′：容量因子Clu液相传质阻力项df：固定液液膜厚度，Cl：

组分在固定液中的扩散系数40涡流扩散（eddydiffusion