《进出境食品添加剂甲壳素分析方法》编制说明

GB/Txxxx—xxxx《进出境食品添加剂甲壳素分析方法》的编制说明一、制标依据本标准是根据2007年出入境检验检疫行业标准制（修）订计划项目，由中华人民共和国绥芬河出入境检检疫局承担，中华人民共和国黑龙江出入境检检疫局,浙江金壳生物化学有限公司协助完成《进出境食品添加剂甲壳素分析方法》的科研课题而研究制定的，其计划编号为20071814-T-424二、 制标原则本标准是按照GB/T1.1-2000《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》和GB/T20001.4-2001《标准编写规则第4部分：化学分析方法》的要求编写的。三、 研究背景甲壳素（chitin,CT）的化学名称为（l,4）-2-乙酰氨基-2-脱氧-0-D-葡聚糖，分子式为（C18H13N05）n,相对分子质量（Mr）为1X106〜2X106,为白色或灰白色无定形半透明固体,无臭,无味，是一种天然生物高分子化合物，它广泛存在于生物界，如海蟹、海贝、海龟以及蘑菇类等生物体中。是地球上贮存量第二大有机化合物，工业生产甲壳素主要以资源丰富的虾蟹壳为原料，经脱钙、脱蛋白、脱色等工艺加工而成。甲壳素应用广泛，可作为食品添加剂，国内甲壳素年生产量达1万吨，80%出口国外，目前尚无甲壳素的国家标准和专业标准。为了完善国内甲壳素（几丁质）卫生安全与质量标准体系，做好甲壳素进出境卫生安全工作，建立食品添加剂甲壳素分析方法。对于甲壳素中铅、砷有害元素的测定，有电感耦合等离子体发射光谱法（1）和原子吸收分光光度法（2），前者对于多种元素的测定，速度快，效率高，线性范围宽，干扰小；后者对于每种元素的测定需要重新选择分析条件，但对于测定某些痕量元素，具有较低检出限，设备简单、易于普及。在铅定中采用常用的灰化和微波消化法处理样品，利用石墨炉原子吸收法测定。砷则采用微波消化法处理样品，应用原子荧光法测定，获得了满意的回收率、精密度和检出限。对于甲壳素中水分、灰分、氮含量的测定，有GB方法参考，但还存在部分条件不适应，通过对水分、灰分、氮含量样品处理条件及测定条件的选择与优化，都能满足食品添加剂甲壳素的检测需要。在参考《SC/T3403—2004，甲壳素与壳聚糖》和相关文献，引用了酸性可溶物和利用测定游离氨基区分甲壳素与脱乙酰甲壳素。四、食品添加剂甲壳素技术指标食品添加剂甲壳素的技术指标如表1：表1甲壳素的技术指标指标名称指 标性状白色、灰白色或淡黄色片状半透明物质、或无定形粉末溶解度溶于浓盐酸、硝酸、硫酸、冰醋酸，不溶于水、稀酸、碱、醇及其他有机溶剂甲壳素（%）70水分（%）10硫酸盐灰分（mg/kg）W3.0酸性可溶物（干态,%）20氮含量（干态,%）=6.2〜6.9铅（mg/kg）10砷（mg/kg）2.0

五、食品添加剂甲壳素实验验证甲壳素性状及溶解性对10份甲壳素(食品级)进行外观和溶解性实验，甲壳素粉末为白色、灰白色或弱带淡黄色无定形，片状为半透明物质。在浓盐酸、硝酸、硫酸、冰醋酸可中溶解，但不溶于水、稀酸、碱乙醇与文献记述相同。甲壳素红外光谱图。溴化钾压片，甲壳素红外光谱图，如图14000 30W 2000 1500 1OOT SOT.OB05_0波数/ch图1甲壳素红外谱图在3450cm-1处有强而宽带吸收峰，表示有缔合一OH伸缩振动，在3200cm-1附近处有弱的N—H伸缩振动，在1660cm-i有较强的吸收峰，为C—O的伸缩振动，在1315cm-i和1379cm-1处的吸收峰分别为CH3和CH2的弯曲振动，在950〜1100cm-1处有一系列较强吸收峰，为C—O—C的伸缩振动。从谱图分析中得知：甲壳素与纤维素的不同之处在于甲壳素具有N—H、C=O的伸缩振动和CH的弯曲振动，而C=O的伸缩较普通C=O的伸缩低，因此甲壳素含有酰胺基(-NHCOCH3)的结构。3.水分的测定等同采用中华人民共和国国家标准GB/T5009.4-2003。直接干燥法测定试样中的水分是简便的、经典的方法，由于甲壳素粉末比重小，且带有静电，在样品铝盒上反扣一个直径稍大的漏斗，可防止空气流动引起试样的散失，利用高精度可控恒温和通风装置的烘箱，烘箱内温度均匀，温度平衡快，烘至恒重时间短，并能减小水分检测误差，称取2g试样测定水分如表2.表2•甲壳素水分测定结果1号2号12次结果(％)均值(%)RSD(%)相对极差(%)12次结果(％)均值(%)RSD(%)相对极差(%)3.35，3.42，3.38，3.37，3.41，3.37，3.38，3.35，3.40，3.32，3.36，3.353.370.8472.977.52,7.65,7.70，7.67,7.70，7.80，7.71，7.79,7.73，7.78，7.80，7.807.721.083.63续表2•甲壳素水分测定结果3号4号12次结果(％)均值(%)RSD(%)相对极差(%)12次结果(％)均值(%)RSD(%)相对极差(%)3.55，3.54，3.60，3.61，3.55，3.51，3.52，3.55，3.62，3.57，3.56，3.573.560.9513.093.43,3.38，3.41，3.43,3.44,3.40,3.40,3.41,3.38,3.393.400.6732.058

4.灰分的测定等同采用JECFA及FCC方法。甲壳素性质稳定，应用GB/T5009.4难以灰化完全，800°C时测定硫酸盐灰分，试样灰化完全，称取1.5g测定灰分如表3表3•甲壳素硫酸盐灰分测定结果1号2号12次结果(％)均值(%)RSD(%)相对极差(%)12次结果(％)均值(%)RSD(%)相对极差(%)1.99，1.96,2.02，2.03，1.99,2.03，1.96,2.00，1.95，2.00，1.98,1.991.991.334.012.66,2.72,2.71,2.70,2.68,2.65,2.70,2.77,2.66,2.712.701.324.44续表3•甲壳素硫酸盐灰分测定结果3号4号12次结果(％)均值(%)RSD(%)相对极差(％)12次结果(％)均值(%)RSD(%)相对极差(%)0.220,0.221,0.221,0.216,0.215,0.221,0.219,0.224,0.218,0.220,0.214,0.2180.2191.314.570.285,0.280,0.283,0.279,0.274,0.278,0.278,0.279,0.275,0.283,0.278,0.2810.2791.163.945.酸性可溶物的测定等同采用中华人民共和国水产行业标准，SC/T3403-2004。甲壳素不溶于水和稀酸，称取1.5g样品测定1%乙酸酸性可溶物如表4表4•甲壳素酸性可溶物测定结果1号2号12次结果(％)均值(%)RSD(%)相对极差(%)12次结果(％)均值(%)RSD(%)相对极差(%)2.67,2.76,2.81,2.73,2.77,2.75,2.69,2.69,2.71,2.65,2.79,2.752.731.815.862.76,2.68,2.78,2.59,2.65,2.74,2.75,2.70,2.77,2.75,2.68,2.732.722.087.00续表4.甲壳素酸性可溶物测定结果3号4号12次结果(％)均值(%)RSD(%)相对极差(％)12次结果(％)均值(%)RSD(%)相对极差(%)3.66,3.46,3.57,3.60,3.53,3.48,3.54,3.62,3.58,3.65,3.62,3.653.581.855.594.12,4.09,4.23,4.11,4.07,4.26,4.20,4.19,4.07,4.10,4.15,4.164.151.524.586.氮含量的测定等同采用中华人民共和国国家标准 GB/T5009.5-2003和中华人民共和国行业标准SN/T0803.9-1999甲壳氮含量测定综合SN/T0803.9和GB/T5009.5方法的优点,设计新型氮含量蒸馏装置。取0.5g试样，加入0.2g硫酸铜(CuSO4・5H2O)、5g硫酸钾、20ml硫酸，稍摇匀，在瓶口放一短颈漏斗，调节电炉500W加热1h,待炭化完全，调节电炉700〜800W继续加热0.5〜1h,取下放冷，加约20ml水，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗烧瓶，洗液并入容量瓶中，加水定容至刻度，连接好蒸馏装置，移取消化液25ml，加入250ml蒸馏瓶中，取250ml

锥形瓶加入25ml硼酸溶液接入冷凝收集端，并使末端插入硼酸溶液中，从蒸馏器上端加入20ml氢氧化钠溶液，盖好盖子，蒸馏，收集溶液，当锥形瓶溶液体积超过100ml,停止蒸馏，以盐酸溶液滴定至终点，计算氮含量如表5表5•甲壳素氮测定结果1号2号12次结果（％）均值（%）RSD（%）相对极差（%）12次结果（％）均值（%）RSD（%）相对极差（%）6.51，6.60,6.63,6.65，6.60,6.70,6.66,6.68,6.60,6.64,6.65,6.786.640.9864.076.77,6.81,6.81,6.72,6.83,6.79,6.76,6.55,6.53,6.47,6.61,6.576.691.945.39续表5.甲壳素氮含量测定结果3号4号12次结果（％）均值（%）RSD（%）相对极差（％）12次结果（％）均值（%）RSD（%）相对极差（%）6.54,6.49,6.67,6.76,6.56,6.68,6.72,6.61,6.48,6.53,6.73,6.506.611.544.247.61,7.71,7.79,7.82,7.71,7.43,7.75,7.50,7.77,7.72,7.50,7.527.651.755.10甲壳素含量的测定（游离氨基测定法）等同采用中华人民共和国水产行业标准，SC/T3403-2004。天然甲壳素和甲壳素生产过程中会部分甲壳素未乙酰化，裸露氨基吸咐H+,溶于稀盐酸,用氢氧化钠滴定溶液中游离H+和氨基吸咐H+，溶液的电导率经过降低、保持不变、升高的过程，出现两个转折点，两个转折点之间即为氨基吸咐H+发生中和反应，据氨基吸咐H+发生中和反应时消耗氢氧化钠溶液量，计算未乙酰化甲壳素的含量，总量中减去未乙酰化甲壳素的含量为甲壳素的含量。如表6表6.甲壳素含量的测定（游离氨基测定法）结果1号2号12次结果（％）均值（%）RSD（%）相对极差（%）12次结果（％）均值（%）RSD（%）相对极差（%）95.3,94.7,95.1,96.0,97.5,93.4,95.2,95.0,95.2,95.0,94.6,95.895.21.014.3093.6,95.7,94.0,96.7,95.4,95.2,95.1,93.2,94.5,96.1,95.01.163.68铅的测定（1） 样品处理方法的选择甲壳素是0氨基葡萄链聚合物，性质稳定，通常方法难消化完全，经研究，选择了干灰化法和微波高压消解法，两者方法比较，结果列于表7，表7.两种样品处理方法的回收率（％）干灰法微波高压消解法12次结果（％）均值（%）RSD（%）相对极差（%）12次结果（％）均值（%）RSD（%）相对极差（%）92,92.1,90.8,101.9,91.8,89.4,88.7,93.7,97.094.04.1814.0102.9,97.9,91.4,104.4,95.2,99.3,95.6,89.8,93.9,91.2,101.3,94.2,96.44.9415.1添加400^g/kg对于干灰化法，称取1g样品，于白金坩埚中，加lml水润湿，搅匀，加盖稍留缝隙，放入马弗炉中进行程序升温，加热消解，完成后，取出，放冷，加lml氢氟酸和lml硝酸，于电热板上150°C蒸干。残渣加2ml硝酸溶液（1：1）溶解，静置lOmin，然后转移到10ml容量瓶中，用水定容至刻度，然后测定。对于微波高压消解，称取0.5g，加4ml硝酸、1ml氢氟酸和2ml过氧化氢，放入微波炉中加热消解，完成后，将消解罐放入赶酸电热板150C，烘干，加入10ml硝酸溶液（1：9）,超声溶解2〜3min，然后测定。马弗炉升温程序：室温〜120C，10min，保持10min，120〜320C,10min，保持15min，320〜550C，10min，保持3h。温度控制微波消解程序：600W,（100%）,室温〜100C,10min，保持10min；600W,（100%）,100〜150C,10min，保持10min；600W,（100%）,150〜180C,10min，保持60min。（2）石墨炉测定条件经消化后，应用原子吸收光谱仪石墨炉测定铅的默认条件，测试铅都有较好回收率，而且空白值较低，背景吸收小，干扰因素少，不需要加基体改进剂，只是钙含量较高的样品影响石墨管的使用寿命，多次使用后灵敏度和重现性降低。（3） 线性范围和检出限配制铅标准溶液，在仪器最佳工作状态下进行测定，获得铅的线性范围为0.5卩g/mL，利用空白溶液连续测定10次，计算标准偏差，对铅标准溶液进行测定，计算直线回归方程，求出曲线的斜率，根据最低检出限计算方法，求得各元素最低检测浓度。回归方程：Abs=0.011Conc+0.026相关系数：0.999最低检测浓度：5^g/kg（4） 方法的回收率和室内精密度称取甲壳素样品0.5g采用微波高压消解法，定容10mL。测定铅三个添加水平，每个水平重复12次实验，其回收率及精密度见表8。表8。铅测定室内精密度实验结果第一添加水平实验（200^g/kg）第二添加水平实验（400^g/kg）第三添加水平实验（800^g/kg）回收率（%）平均回收率（％）RSD(%)回收率（%）平均回收率（％）RSD(%)回收率（%）平均回收率（％）RSD(%)89.9,84.7,102.9,97.9,102.2,96.6,91.3,93.9,91.4,104.4,103.4,99.3,88.6,89.1,90.43.5695.2,99.3,96.44.9494.4,98.1,97.23.7894.2,87.7,95.6,89.8,96.2,95.2,90.4,95.0,93.9,91.2,101.0,92.4,93.3,87.0,101.3,94.2,91.9,96.0,砷的测定（1） 样品处理方法的选择对于甲壳素中砷测定，称取0.5g试样，加4ml硝酸、1ml氢氟酸和2ml过氧化氢，进行微波炉中加热消解，完成后，将消解罐放入可调恒温赶酸电热板中150C烘干，加入5ml硝酸溶液（1：1）,超声溶解2〜3min,然后转移到25ml容量瓶中，加入2ml硫脲溶液（50g/L）,用硝酸溶液（10%）定容至刻度，超声混溶5min测定。温度控制微波消解程序：600W,（100%）,室温〜100C,10min,保持10min；600W,（100%）,100〜150C,10min,保持10min；600W,（100%）,150〜180C,10min,保持60min。（2） 原子荧光测定条件经消化后，应用原子荧光测定砷的默认条件测试都有较好回收率，干扰因素少，灵敏度高，重现性好。（3） 线性范围和检出限配制砷标准溶液，在仪器最佳工作状态下进行测定，获得砷的线性范围为200ng/ml，利用空白溶液连续测定10