核酸分子杂交技术

核酸分子杂交技术核酸分子杂交概念

核酸分子杂交是应用DNA变性和复性的原理建立的一种经典的分子生物学技术。

两条不同来源的单链核酸，只要它们有相同的互补碱基顺序，经退火处理即可复性，形成新的异源核酸分子的双链结构。此即为核酸分子杂交此杂交过程是高度特异的，杂交的双方是待测核酸及探针。

分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间进行。核酸探针（nucleicacidmolecularprobe）：指一已知的带有标记的核酸片段，能与互补核酸序列进行退火杂交，可用于待测核酸样品中特定基因序列的探测。核酸探针一、常见核酸探针的种类（一）基因组DNA探针

1.来源：这类探针来源于某种生物的基因组多为某一基因的全部或部分序列。

2.制备方法:

（1）基因克隆的方法（2）聚合酶链反应(PCR)

3.特点:

（1）克隆在载体中的DNA片段，

可以无限繁殖，取之不尽。（2）PCR制备探针更加简便和省时。（3）相对RNA而言，DNA探针不易降解，标记方法也较成熟。（二）cDNA探针1.制备:cDNA(complementaryDNA)是指与mRNA互补的DNA分子。2.特点:（1）不存在内含子和高度重复序列，是一种较理想的核酸探针，尤其是用于基因表达的研究。（2）cDNA探针的制备受RNA酶的影响，但随着反转录试剂盒的商品化，cDNA探针的制备现已成为分子生物学实验室的常规实验。

（三）RNA探针

特性：大多以单链形式存在，几乎不存在互补双链的竞争结合，RNA探针与靶序列的杂交效率较高，稳定性也高；

RNA分子中不存在高度重复序列，减少非特异性杂交，杂交后可用RNA酶将未杂交的探针分子水解去除，降低本底的干扰；但RNA探针有易降解和标记方法复杂等缺点，限制了其广泛应用。（四）寡核苷酸探针

1.制备：人工合成

2.特点:◆根据需要来合成相应的核酸序列，避免天然探针的缺点◆大多数寡核苷酸探针长度一般为10~50bp◆寡核苷酸探针尤其适合点突变的检测◆探针的长度较短，特异性较低，杂交信号较弱，但经过精心设计仍可设计出非常特异的寡核苷酸探针

3.设计原则:

◆探针长度：一般要求在10～50bp

◆G／C含量为40％～60％◆探针分子中应避免互补序列◆避免同一碱基连续出现，一般不能多于4个，如GGGG-或-CCCC-◆借助计算机相应软件与已知的各种基因序列进行同源性比较，与非靶基因序列的同源性不能超过70％或8个以上连续的碱基二、核酸探针的标记

一个理想的探针标记物应具有以下特性：

◆灵敏度高

◆标记物与探针结合后，应不影响杂交反

应，尤其是杂交特异性、稳定性和Tm值

◆检测方法要灵敏、特异、稳定、简便

◆标记物对环境污染小，对人体无损伤，价格低廉

◆标记物对检测方法无干扰。（一）探针常见标记物：

1、放射性同位素标记物优点：灵敏度高，＜1000个分子；特异性强缺点：放射性污染，有半衰期常用于标记探针的同位素：32P、3H、35S、131I、125I

2、非放射性标记物（1）生物素标记核酸探针生物素-UTP的结构示意图

（2）光敏生物素标记核酸探针光敏生物素结构图

（3）地高辛标记核酸探针

（4）酶标记核酸探针：ALP、HRP

（5）荧光素标记核酸探针：异硫氰酸荧光素

（二）核酸探针的标记方法1、酶促反应标记法：

将标记物预先标记在单核苷酸（NTP或dNTP）分子上，采用酶促反应将标记物掺入到核酸探针分子中。特点：灵敏度高，但标记过程复杂、成本高2、化学修饰标记法：利用标记物分子上的活性基团与分子探针上的某些基团发生化学反应，将标记物直接结合到探针分子上。特点：方法简单、成本低。（1）缺口平移法（nicktranslation）缺口平移标记法示意图

核酸探针的酶促标记方法（2）随机引物法(randompriming)

随机引物标记法示意图

（3）DNA探针的末端标记

1）Klenow大片段的末端标记法

利用KlenowDNA聚合酶标记3’-端DNA探针

2）T4噬菌体多核苷酸激酶标记法

（polynucleofidekinase，PNK)T4噬菌体多核苷酸激酶标记法示意图（4）聚合酶链反应（PCR）标记DNA探针

（5）同位素标记RNA探针

1）SP6RNA聚合酶体系

2）成对启动子系列

RNA探针标记

三、标记探针的纯化

（一）凝胶过滤层析法

（二）乙醇沉淀法四、探针的检测（一）放射性同位素标记探针的检测

1.放射自显影

2.γ计数器

（二）非放射性标记探针的检测

1．偶联反应

非放射性探针检测示意图

2．显色反应

(1)酶促显色法

①碱性磷酸酶(ALP)显色体系

②辣根过氧化物酶(HRP)显色体系

(2)荧光法

(3)化学发光法标记物性质标记分子标记方法检测方法放射性分子[α32P]dNTPNT、PCR、RP放射自显影或计数[γ32P]dNTPTL放射自显影或计数35SNT放射自显影或计数

3HNT放射自显影或计数非放射性分子生物素Bio-11-dUTPNT、PCR、RP酶标亲和素或酶标光敏生物素600W可见光照抗生物素抗体显色生物素化补骨脂素365紫外线照抗生物素抗体显色酶过氧化物酶化学合成法或直接法直接底物显色或用酶抗体+底物显色碱性磷酸酶化学合成法或直接法直接底物显色或用酶抗体+底物显色荧光素罗丹明和FITC合成法荧光显微镜观察或酶标抗体+底物显色半抗原地高辛RP、NT酶标抗体+底物显色常用核酸探针的标记和检测注：NT：缺口平移；PCR：聚合酶链反应；RP：随机引物；TL：末端标记

核酸分子杂交技术

按反应支持物可分为固相杂交和液相杂交两种固相杂交应用较广，包括Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、菌落杂交、斑点杂交、原位杂交等。杂交类型检测目的及范围Southern印迹杂交检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的DNA分子Northern印迹杂交检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的RNA分子菌落杂交检测固定在膜上，经裂解从细菌体释放的DNA分子斑点杂交检测固定在膜上的DNA或RNA分子原位杂交检测细胞或组织中的DNA或RNA分子各种固相杂交方法的适用范围一、Southern印迹杂交[原理]

Sourthern印迹杂交是分析DNA的一种方法，从细胞或组织中提取高分子量的DNA，用一种或多种限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳按大小分离所得片段，从凝胶中按原来位置和顺序吸印转移到固相支持膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，然后再与同位素或非同位素标记探针杂交，最后经放射自显影或显色反应进行检测。Southern杂交示意图

（一）DNA的变性：将琼脂糖凝胶电泳分离的DNA限制性酶切片段进行变性（二）中和（三）Southern印迹1．毛细管转移2．电转移法3．真空转移法（四）预杂交（五）杂交（六）洗膜（七）杂交信号的检测[步骤]

毛细管转移示意图电转移示意图

二、Northern印迹杂交（一）基本步骤

Northern印迹杂交流程图

（二）与Southern印迹杂交比较

◆RNA提取过程中需特别注意RNA酶的污染。

◆所用的器材最好与Southern印迹实验的分开

使用。

◆RNA变性的方法与DNA不同，它是在变性

剂(甲醛或聚乙二醛、甲基氢氧化汞)的存在

下进行电泳,其作用是防止RNA分子形成发夹

式的二级结构，以保持其单链线形状态。

◆印迹前将含甲醛(变性剂)的凝胶用水冲洗掉，

再印迹、杂交。

◆如果测定RNA片段大小，可在同一块胶上加

分子量标记物一同电泳，之后将标记物切

下、上色、照像，样品胶则进行Northern

转印。

三、斑点杂交与狭缝杂交斑点杂交示意图

斑点杂交不需电泳和转膜过程，整个操作过程简便、快速。但结果无法判断核酸片段的大小，也无法判断样品溶液中是否存在着不同的靶序列，多用作核酸定性或半定量分析，而且便于杂交条件的摸索。

四、菌落杂交菌落杂交示意图

五、原位杂交

原位杂交（Insituhybridization）是以特定标记的已知序列的核酸分子作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其检测的方法。

（一）基本方法1．细胞或组织切片的处理（1）玻片清洗（2）组织和细胞的固定应用和选择固定剂上需考虑以下因素:◆保持细胞形态，最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平◆探针易于进入细胞或组织◆不影响核酸与探针的杂交

2.增强组织的通透性和核酸探针的穿透性

组织细胞中的核酸都以核蛋白复合体的形式存在于细胞浆或细胞核中，经过固定过程后，胞浆或胞核内生物大分子交联形成网络结构，影响探针的穿透和杂交体的形成。因此需要使用去污剂和蛋白酶对组织细胞蛋白进行水解以去除核酸表面蛋白。

常用的去污剂：TritonX-100、十二烷基硫酸钠（SDS）常用的蛋白酶：蛋白酶K、胰蛋白酶、胶原蛋白酶等。去蛋白作用：可增强组织的通透性和核酸探针的穿透性，提高杂交信号，但同时也会减低RNA的量和影响组织细胞的形态，在实验过程中须根据组织种类、切片的厚度等因素经过预实验来确定其适宜的浓度和消化时间，否则将影响实验结果甚至导致实验失败。

3.预杂交（Prehybridization）

预杂交的目的与其它固相杂交相同，

将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非

特异性杂交位点的作用，从而降低背景染

色。

4.杂交（Hybridization）原位杂交是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片。杂交液的成分和预杂交液基本相同，其不同的是前者加入了标记的核酸探针和硫酸葡聚糖。硫酸葡聚糖是一种大分子的多聚胺化合物，具有极强的水合作用，因而能大大增加杂交液的粘稠度，提高杂交率。

杂交过程中须注意的问题：

（1）探针的浓度

（2）探针的长度：50～100bp

（3）杂交的温度和时间：Tm-25℃，3h

5.杂交后处理洗涤的条件包括盐溶液的浓度、温度、洗涤次数和时间，一般遵循的原则是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。值得注意的是在漂洗的过程中，切勿使切片干燥，否则反而会增强背景染色。

6.结果检测根据核酸探针标记物的种类来选择相应的检测系统。细胞或组织的原位杂交切片在显示后均可进行半定量的测定。

放射自显影：可利用人工或计算机辅助的图象分析检测仪检测银粒的数量和分布的差异。

非放射性核酸探针杂交：可利用相应的检测系统显色，然后利用图像分析仪对不同类型和数量的核酸的显色强度进行检测。需要注意的是：做半定量测定必须注意严格控制实验的一致性。六、荧光原位杂交

荧光原位杂交

（fluorescencein-situhybridization,FISH）

是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。

（一）荧光素标记检测系统

1．生物素标记探针与荧光素标记的抗生物素或抗生物素抗体

2．地高辛标记的抗体与荧光素标记的抗地高辛抗体

3．氨乙酰基荧光（aminoacetylfluroence,AAF）-改良探针与抗AAF抗血清等。上述的检测系统有直接法和间接法两种，后者灵敏度更高

七、液相核酸分子杂交

原理是将待测核酸分子和核酸探针都游离在溶液中，在一定条件下进行杂交。

（一）羟基磷灰石吸附杂交（二）亲和吸附杂交（三）磁珠吸附杂交核酸分子杂交技术的应用1、分子生物学研究领域：克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定位等。2、临床疾病诊断方面：遗传疾病的基因诊断、恶性肿瘤的基因分析、传染病病原体的检测、优生优育等。THANKS!CotanalysisofDNAreassociation不同物种DNA的Cot曲线什么是核酸分子杂交？

核酸分子杂交是利用DNA具有变性和复性的特性而建立起来的一种分子生物学技术.其原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下根据碱基互补的原则可以形成双链.

使具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下（适宜的温度和离子强度等），按碱基互补配对原则形成双链杂交体的一类技术就称为核酸分子杂交技术。用于定性或定量检测特异RNA或DNA片段。从以下几方面了解核酸杂交：第一节核酸分子杂交基本原理：核酸变性、复性及杂交概念第二节核酸探针：探针的设计、标记、纯化及检测第三节核酸分子杂交技术：Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、斑点杂交、菌落杂交、原位杂交