第18章色谱法导论-32h

第18章色谱法导论第一节概论色谱法的最早应用是用于分离植物色素，其方法是这样的：在一玻璃管中放入碳酸钙，将含有植物色素（植物叶的提取液）的石油醚倒入管中。此时，玻璃管的上端立即出现几种颜色的混合谱带。然后用纯石油醚冲洗，随着石油醚的加入，谱带不断地向下移动，并逐渐分开成几个不同颜色的谱带，继续冲洗就可分别接得各种颜色的色素，并可分别进行鉴定。色谱法也由此而得名。玻璃管为色谱柱，管内的碳酸钙填料为固定相，石油醚淋洗液为流动相。现在的色谱法早已不局限于色素的分离，其方法也早已得到了极大的发展，但其分离的原理仍然是一样的。色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分离技术，能够分离性质相近的多组分复杂混合物。将色谱法用于分析化学并配合适当的检测手段，就成为色谱分析法。色谱法分类1.按固定相形态分类柱色谱：固定相装在色谱柱内。包括填充柱、整体柱、毛细管柱或开管柱。平面色谱：固定相呈平面状。包括薄层色谱和纸色谱。色谱法液相色谱法气相色谱法气-液色谱法气-固色谱法液-固色谱法液-液色谱法2.按两相的物理形态、分离机理分类第二节基本概念色谱分离体系由两部分组成：一相是固定不动的，我们把它叫做固定相；另一相则不断流过固定相，我们把它叫做流动相。当流动相以一定速率流经色谱柱，试样中各个组分在流动相和固定相之间进行连续多次分配。组分与固定相和流动相之间的作用力有差别，因而组分在两相中分布常数不同。在固定相上吸附力大的，即分布常数大的，迁移数率慢，保留时间长；在固定相上吸附力小，即分布常数小的，迁移数率快。试样中各组分同时进入色谱柱，但是在不同时间从色谱柱中洗出，实现分离。混合组分的分离过程及检测器对各组份在不同阶段的响应试样组分在色谱体系中运行的特点：1.差速迁移：混合物中不同组分的迁移速率不同差速迁移(保留值的大小)取决于组分与固定相、流动相作用力的差异2.分子分布离散：同种组分分子在迁移过程中分布空间扩展分子分布离散取决于同种分子运动速率的差异色谱分离要求：差异速率(保留值大)，分子分布离散(色谱区带)窄。2.分布平衡色谱涉及溶质在两相中的分布平衡，平衡常数K称为分布系数或分配系数K=cs/cmcs是溶质在固定相的浓度，cm是溶质在流动相中的浓度，K是溶质在两相中分布平衡性质的度量，反映溶质与固定相、流动相作用力差别。K只与固定相和温度有关，与两相体积、柱管特性和所用仪器无关。温度、溶质一定时，K主要取决于固定相性质。每个组份在各种固定相上的分配系数K不同；组分的分配系数K越小，出峰越快；组分的分配系数K越大，出峰越慢；某组分的K=0时，即不被固定相保留，最先流出。选择适宜的固定相可改善分离效果；试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础；3.色谱流动相流速稳定的流动相流速是色谱系统正常运行的基本条件。流动相的流速通常有两种表达方式体积流量FcmL/min，单位时间流过色谱柱的平均体积。Fc采用容器收集柱后一定时间内流出流动相的体积进行测定。线速度cm/min，mm/min，单位时间内流动相流经色谱柱的长度由柱长L和死时间tM求出，=L/tM4.色谱图分离试样各组分依次进入柱后，由检测器产生检测信号，响应信号大小对时间或流动相流出体积的关系曲线为色谱图。色谱图的横坐标是时间或流动相体积，纵坐标是组分在流动相中浓度或检测器响应信号大小，色谱图是色谱分析的主要技术资料，色谱包含的色谱信息1.说明试样是否是单一纯化和物。正常色谱条件下，如果色谱图有一个以上色谱峰，说明试样中有一个以上组分。色谱图能够提供试样中的最低组分数。2.说明色谱柱效和分离情况，可定量计算出表征色谱柱效的理论塔板数、评价相邻物质对分离优劣的分离度。3.提供各组分保留时间等色谱定性数据。4.给出个组分色谱峰高、峰面积等定量数据。色谱图基线：在实验条件下，色谱柱后仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线称为基线。基线在稳定的条件下应是一条水平的直线。它的平直与否可反应出实验条件的稳定情况。色谱峰高(h)：色谱峰顶点与基线的距离叫峰高。峰面积：色谱峰与峰底基线所围成区域的面积叫峰面积。色谱峰区域宽度：色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，可用于衡量色谱柱的柱效及反映色谱操作条件下的动力学因素。宽度越窄，其效率越高，分离的效果也越好。区域宽度通常有三种表示方法：标准差：峰高0.607倍处峰宽处的一半。半峰宽W1/2：峰高一半处的峰宽。W1/2=2.354峰底宽W：色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间的距离。W=4。5.保留值保留值是试样各组分在色谱柱或色谱体系中保留行为的度量，反映溶质与色谱固定相作用力类型和大小，是色谱热力学参数和定性依据。比移值Rf：溶质通过色谱柱的平均线速度u与流动相平均线速度ux之比。溶质分子在流动相中消耗的时间分数等于溶质分子在流动相中分布的分子分数，这样得到：nm和ns分别为溶质在流动相和固定相的分子数或物质的量。溶质在流动相中消耗的时间越多，nm越大，ux越大，Rf也越大。如果溶质在流动相中消耗时间分数为1，即溶质一直在流动相中迁移，未在固定相中停留，ux=u，Rf=1。如果溶质一直停留在固定相，谱带不随流动相迁移，则ux=0，Rf=0。通常，0<Rf<1死时间(tM)：不与固定相作用的物质从进样到出现峰极大值时的时间。由于该物质不与固定相作用，因此，其流速与流动相的流速相近。tM=L/u实际应用中，采用与流动相性质相近、不与固定相发生作用的物质。气相色谱一般用空气，液相色谱用与流动相性质相近的溶剂。保留时间tR：试样从进样到出现峰极大值时的时间，tM=L/ux它包括组份随流动相通过柱子的时间tM和组份在固定相中滞留的时间。调整保留时间tR׳：某组份的保留时间扣除死时间后的保留时间，它是组份在固定相中的滞留时间。tR׳=tR-tM死体积VM：死时间内流经色谱柱的流动相的体积VM=tMFcFc为柱出口的载气流速(mL/min)保留体积VR：保留时间内流经色谱柱的流动相体积VR=tRFc调整保留体积VR׳：在调整保留时间内流经色谱柱的流动相体积VR׳=tR׳Fc=VR-VM保留因子k:溶质分布在固定相和流动相的分子数或物质的量之比ns和nm分别为溶质在固定相和流动相的分子数或物质的量cs和cM是溶质在固定相和流动相中的浓度Vs和VM是色谱柱中固定相和流动相当体积k也等于组分的校正保留时间与死时间的比值k可通过实验测得。由此也可知道，k可表示出组分在柱中停留时间的长短。k越大，停留时间也就越长。还可推导出几种保留值与k的关系相对保留值对A、B两组分的相对保留值，用下式表示：

=tRA/tRB=kA/kB=KA/KB对固定相的选择具有实际意义。如果两组分的K或k值相等，则=1，两个组分的色谱峰必将重合，说明分不开。两组分的K或k值相差越大，则分离得越好。因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。第三节溶质分布谱带展宽理想色谱过程指溶质在两相间物质交换在热力学上可逆，传质速率很高，瞬间实现平衡，同时忽略分子扩散。线性理想色谱：溶质在两相间分布呈线性，溶质在色谱柱内迁移为理想状态，可以用简单的理论模型和数学方法求出溶质浓度分布。线性非理想色谱：大部分分配色谱非线性理想色谱：液固吸附色谱非线性非理想色谱：气固吸附色谱2.塔板理论塔板理论是描述色谱柱中组分在两相间的分配状况及评价色谱柱的分离效能的一种半经验式的理论。塔板理论将一根色谱柱当作一个由许多塔板组成的精馏塔，用塔板概念来描述组分在柱中的分配行为。塔板是从精馏中借用的，是一种半经验理论，但它成功地解释了色谱流出曲线呈正态分布。塔板理论假定：1）色谱柱由内径一致，填充均匀的塔板组成，塔板高度H均相等。2）塔板之间不连续，且塔板之间无分子扩散。3）某组分在所有塔板上的分配系数相同，组分在各塔板内两相间的分配瞬间达至平衡，达一次平衡所需柱长为理论塔板高度H。4）流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔板体积加入。溶质在色谱柱内分布平衡塔板理论是把色谱柱假想为一个精馏塔，塔内存在许多塔板，组分在每个塔板的气相和液相间进行分配，达成一次分配平衡。然后随着流动相按一个塔板、一个塔板的方式向前移动。经过多次分配平衡后，分配系数小的组分，先离开蒸馏塔（色谱柱），分配系数大的组分后离开蒸馏塔（色谱柱），从而使分配系数不同的组分彼此得到分离。分离过程如下图所示为简单起见，设色谱柱由5决塔板（n=5，n为柱子的塔板数）组成，并以r表示塔板编号。r=0，1，2，3，4，5；某组分的分配比k=1。开始时，将单位质量（即m=1）的该组分进入0号塔板上，然后将流动相以一个板体积（△V）一个板体积的脉冲形式进入色谱柱；此时组分将按下表所示在固定相和流动相进行分配：板号r载气体积0123进样mM0.5mS0.5△VmM0.250.25mS0.250.252△VmM0.1250.125+0.1250.125mS0.1250.125+0.1250.1253△VmM0.0630.063+0.1250.063+0.1250.063mS0.0630.063+0.1250.063+0.1250.063按上述分配过程，对于n=5，k=1，m=1的体系，随着进入柱中板体积载气的增加，组分分布在柱内任一板上的总量（气相和液相的总质量）见下表：nr01234出口010000010.50.5000020.250.50.2500030.1250.3750.3750.1250040.0630.250.3750.250.063050.0320.1570.3130.3130.1570.03260.0160.0950.2350.3130.2350.07970.0080.0560.1160.2740.2740.11880.0040.0320.0860.1960.2740.13390.0020.0180.0590.1410.2360.138100.0010.0100.0380.1000.1890.118

n

r01234出口1100.0050.0240.0690.1450.0951200.0020.0160.0460.1070.0731300.0010.0080.0300.0760.05414000.0040.0190.0530.03815000.0020.0120.0360.02816000.0010.0080.0240.018由表中可见，当n=5时，即5个塔板体积的流动相进入柱中时，组分就开始从柱口流出。并且呈现先小后大的情况。以上是当塔板数为5时的情况，出现的峰形不对称，这是由于塔板数太少的原因。当塔板数大于50时，峰形就是对称的。在实际色谱柱中，n值很大（约为106～109）。所以色谱峰一般为正态分布。理论塔板的计算公式：对于一个柱子下说，其理论塔板数n可由下式计算：式中：tR为某组分的保留时间，2Δt1/2为某组分色谱峰的半高宽度，W为色谱峰的峰底宽度。由式可见，柱子的理论塔板数与峰宽和保留时间有关。保留时间越大，峰越窄，理论塔板数就越多。柱效能也就越高。对于一个柱长固定为L的柱子，其理论塔板高度H为每一个塔板的高度，即组分在柱内每达成一次分配平衡所需要的柱长叫理论塔板高度。它越小，也表示柱效能越高。单位柱长的理论塔板数n或板高H常用作色谱柱效的指标。在以上计算理论塔板数的式子中使用的是保留时间，它包括了死时间，它与组分在柱内的分配无关，因此不能真正反映色谱柱的柱效。为此，引入了有效塔板数的概念。同理有效塔板高度为：理论塔板数(高度)和有效理论塔板数(高度)的关系：塔板理论的特点：(1)当色谱柱长度一定时，塔板数n越大(塔板高度H越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。(2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。(3)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。(4)塔板理论无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。3.速率理论-范弟姆特方程式塔板理论是一个半经验性的理论。它定性的给出了板高的概念，但不能指出影响板高的因素。速率理论就是在塔板理论的基础上，给出了影响塔板高度的因素：u为流动相线速度；A，B，C为常数，其中A—表示涡流扩散系数；B/u—分子扩散因数；Cu—传质因数（包括液相和固相传质阻力系数）；Cs和Cm分别为流动相和固定相传质项系数。该式从动力学角度很好地解释了影响板高（柱效）的各种因素！任何减少方程右边三项数值的方法，都可降低H，从而提高柱效。1）涡流扩散项(A)在填充柱中，由于受到固定相颗粒的阻碍，组份在迁移过程中随流动相不断改变方向，形成紊乱的“涡流”：从图中可见，因填充物颗粒大小及填充的不均匀性——同一组分运行路线长短不同——流出时间不同——峰形展宽。展宽程度以A表示：A=2dp其中dp—填充物平均直径；—填充不规则因子。

可见，使用细粒的固定相并填充均匀可减小A，提高柱效。对于空心毛细管柱，无涡流扩散，即A=0。流动方向2）纵向扩散项(B/u)纵向分子扩散是由于浓度梯度引起的。当样品被注入色谱柱时，它呈“塞子”状分布。随着流动相的推进，“塞子”因浓度梯度而向前后自发地扩散，使谱峰展宽。其大小为B=2D—称为弯曲因子，它表示固定相几何形状对自由分子扩散的阻碍情况；D—组分在流动相中的扩散系数(cm2/s)。组份为气体或液体时，分别以Dg或Dm表示；分子量大的组分，Dg小，即B小,Dg

随柱温升高而增加，随柱压降低而减小；流动相分子量大，Dg小，即B小，u增加，组份停留时间短，纵向扩散小；（B/u）对于液相色谱，因Dm较小，B项可勿略。球状颗粒；大分子量流动相；适当增加流速；短柱；低温。3）传质阻力项(Cu)因传质阻力的存在，使分配不能“瞬间”达至平衡，因此产生峰形展宽。气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，二者传质过程不完全相同。下面分别作讨论。a）固定相传质阻力系数：传质阻力项系数Cs是保留因子k的一个复杂函数，与固定液膜厚度df平方成正比，与固定相内地扩散系数Ds成反比。q是一个由固定项颗粒形状和孔结构决定的结构因子气体流动相对传质项Cm也是保留因子k的一个复杂函数，正比于柱填料粒径dp的平方，反比于溶质在气体流动相内的扩散系数Dm。固定相传质阻力与液膜厚度df、保留因子k和扩散系数Ds等有关。降低固定相传质阻力的方法有：减小液膜厚度df

；采用分子量小的流动相，使Ds增加；增加柱温，可增加Ds，但k值也减小，为保持合适Cs值，应控制柱温。流动相传质阻力包与填充物大小dp、扩散系数Dm、微孔大小及其数量等有关。降低流动相传质阻力的方法有：细颗粒固定相、增加组分在固定相和流动相中的扩散系数D、适当降低线速度、短柱。影响柱效的变量1.流动相流速由方程H=A+B/u+Cu知道：当u一定时，仅在A、B、C较小时，H较小，柱效较高；反之则柱效较低，色谱峰将展宽。以u对H作图，可得H-u曲线（如图），从该曲线得到：板高，H(cm)HminA+B/u+CuCuAB/u涡流扩散项A与流速u无关；低流速区(u小)，B/u大，分子扩散项占主导，此时选择分子量大的气体如N2和Ar为载气，可减小扩散，提高柱效；高流速区(u大)，Cu大，传质阻力项占主导，此时选择分子量小的气体如H2和He为载气，可增加扩散系数，提高柱效；

LC的Hmin和uopt均比GC的小一个数量级，即在

LC中，较低流速可获得较大的柱效。

曲线的最低点对应最佳线速uopt()下的最小板高Hmin()；2.填料粒径dp大小对板高的影响实验表明，颗粒越细，板高越小，受线速影响越小。即在HPLC分析中采用细粒作固定相的理论根据！但颗粒细导致柱流速慢，当采用高压技术，才能实现HPLC的分析要求。板高,H(cm)3.色谱柱温温度影响扩散系数Ds和Dm，从而影响分子扩散和传质速率。温度变化对色谱过程分子扩散和传质的影响是矛盾的：柱温升高，Ds和Dm升高，但k值也减小，要选择合适的温度。色谱分离中的四种典型情况①分离效果差，柱效低，选择性（）低②完全分离，柱效高，峰窄，选择性（）低；③完全分离，选择性（）增加，柱效低，峰宽④完全分离，柱效高，选择性（）好第四节基本分离方程1.分离度同时反映色谱柱效能和选择性的一个综合指标。也称总分离效能指标或分辨率。其定义为：R越大，相邻组分分离越好。当R=1.5时，分离程度可达99.7%，因此R=1.5通常用作是否分开的判据。R=1.0时，分离程度达到96%,称为基本分离。R=1.5R=0.75R=1.0响应信号保留时间t,min2.色谱分离方程R的定义并未反映影响分离度的各种因素。也就是说，R未与影响其大小的因素：柱效n(动力学)、选择因子和保留因子k(热力学)联系起来。对于相邻的难分离组分，由于它们的分配系数K相差小，可合理假设k1k2=k，W1W2=W。因此可导出R与n、和k的关系有关分离方程的讨论：1）分离度R与柱效的关系分离度R与理论塔板数N有关，即R受热力学性质的影响。由色谱方程可得：因此可通过增加柱长提高分离度。然而，分析时间也相应增加，且峰宽也展宽！为提高柱效，用减小塔板高度H的方法比增加柱长更有效。理论塔板数N：2）分离度R与保留因子的关系越大，柱选择性越好，对分离有利。的微小变化可引起R较大改变。如，当从1.01增加至1.10(增加9%)时，R则增加9倍(但>1.5,R增加不大)。改变的方法有：降低柱温、改变流动相及固定相的性质和组成。

3）分离度R分配比k的关系

k增加，分离度R增加，但当k>10，则R的增加不明显。通常k在2~10之间。改变k的方法有：适当增加柱温(GC)、改变流动相性质和组成(LC)以及固定相含量。70%CH3OH+30H2O60%CH3OH+40H2O50%CH3OH+50H2O40%CH3OH+60H2O溶剂(流动相)组成对色谱分离的影响(梯度淋洗)1：9,10-蒽醌；2：2-甲基-9,10-蒽醌；3：2-乙基-9,10-蒽醌4：1,4-二甲基-9,10-蒽醌；5：2-特丁基甲基-9,10-蒽醌；改变组成使k最佳3.分析时间t分析时间通常指最后一个组分出峰的时间。其值为可见，分析时间与R，，k、H/u等参数有关。R增加1倍，分析时间则是原来的4倍。实际工作中，即要能获得有效的分离，又要在较短时间内完成分析。例：两物质A和B在30cm长的色谱柱上的保留时间分别为16.4和17.63min，有一不与固定相作用的物质，其在此柱上的保留时间为1.30min。物质A和B的峰底宽分别为1.11和1.21min。试问：1）柱分辨率R；2）柱平均理论塔板数nav3）平均塔板高度Hav4）若要求R达到1.5，则柱长至少应为多少？5）使用上述较长的柱进行分析时，其分析时间为多长？6）不增加柱长，要求在原来的分析时间内R达到1.5，该柱的塔板高度应为多少？1）柱分辨率R；2）柱平均理论塔板数nav3）平均塔板高度Hav44）若要求R达到1.5，则柱长至少应为多少？5）使用上述较长的柱进行分析时，其分析时间为多长？6）不增加柱长，要求在原来的分析时间内R达到1.5，该柱的塔板高度应为多少？第五节色谱方法选择方法选择根据试样物理、化学性质和分析要求来选择色谱方法：各种气体、沸点500℃以下具有挥发性的试样，采用气相色谱分析。非挥发性试样，包括有机物、无机物、高分子化合物、可解离化合物采用高效液