第十三章动物细胞融合

第13章动物细胞融合一、动物细胞融合（一）、概念

动物细胞融合也称细胞杂交，是指在自然条件下或用生物、化学、物理等人工方法，使两个或多个细胞相互接触，从而发生膜融合、质融合和核融合，并形成杂种的过程。1984年单克隆抗体技术的创始人剑桥大学阿根廷学者CesarMilstein和英国学者GeogerKohler获得了诺贝尔医学及生理学奖。（二）、动物细胞融合的应用及意义打破生殖隔离创造新物种？生产单克隆抗体单克隆抗体抗体二、抗体（一）、概述

抗体是在对抗原刺激的免疫应答中，B淋巴细胞产生的一类糖蛋白。它是能与相应抗原特异的结合、产生各种免疫效应（生理效应）的球蛋白。国际卫生组织将具有抗体活性及化学结构与抗体相似的一类蛋白统一命名为免疫球蛋白，它与抗体都是指同一类蛋白质。由两条重链和两条轻链组成“Y”型蛋白分子。

IgG、IgM、IgA、IgE和IgD

五种免疫球蛋白（二）、单克隆抗体与多克隆抗体

1、定义多克隆抗体：同一抗原上的多个抗原决定簇同时刺激机体产生的针对不同抗原决定簇的抗体混合物（即在免疫反应中，混合物中的抗体均能与同一抗原起反应，只是针对的抗原决定簇不一样,该抗体是多个B淋巴细胞分泌的）单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb)单纯针对某一抗原上的某一抗原决定簇的抗体，通常由合成该专一性抗体的单克隆B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后的杂交细胞(杂种瘤)大量产生，分离纯化而得

单克隆抗体与多克隆抗体如何制备单克隆抗体特点：

高度特异性

高度稳定性

高抗体活性

生物活性单一单克隆抗体与‘抗癌药物’或‘毒素’结合在一起就是所谓的‘生物导弹’第一代单克隆抗体经杂交瘤细胞生产第二代单克隆抗体经过基因重组的嵌合或人源化单克隆抗体单克隆抗体的局限性单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高单克隆抗体制备原理单克隆抗体如何获得单克隆抗体技术：指将产生单一抗体的B淋巴细胞与具有无限增殖的骨髓瘤细胞相互融合，产生具有两亲本特性的杂交瘤细胞，生产单克隆抗体的技术。

单克隆抗体（McAb）是近年来增长率最大的一蛋白类药物，2001年全球销售额接近30亿美元。在这类产品中开发主要集中在癌症治疗药物方面。2世界上现有单克隆抗体种类以及治癌药品2010年全球治疗用单抗药物的销售总额达到440亿美元，100亿美元的单抗诊断和研究试剂，2011年单抗药物的市场总量已经达到628亿美元。到2015年，全球单克隆抗体药销售额有望达980亿美元左右。目前我国单抗市场规模每年以50%以上的速度递增。（来自百度）

三、单克隆抗体的制备1、抗原与动物免疫（1）动物选择生产抗体的免疫动物也采用BALB/C型小鼠。（一）、B淋巴细胞的制备分泌特异抗体的（2）、抗原可溶性抗原：蛋白质、核酸、多肽、多糖等抗原类型颗粒性抗原：病毒、细菌、真菌、细胞等（3）、免疫途径腹腔注射：适合于颗粒性抗原三种方式皮下淋巴样器官注射静脉注射：为了取得更好的免疫效果时使用2、B淋巴细胞的分离最后一次免疫后3～5天即可取脾脏分离细胞（二）、骨髓瘤细胞的制备骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合过程中，会有五种不同类型细胞产生骨髓瘤细胞B淋巴细胞B淋巴细胞B淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞B淋巴细胞1、骨髓瘤细胞的选择骨髓瘤细胞来源于BALB/C小鼠，选择亲本骨髓瘤细胞自身不能分泌任何抗体，且HGPRT¯或TK¯。HGPRT¯指次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷株TK¯指胸腺嘧啶核苷酸激酶缺陷株常用的骨髓瘤细胞系全名简称来源耐受P3-X63-Ag8X63BALB/C8-AgMopcll-X45-6TGX45BALB/C6-TGP3-NS1-Ag4.1NS-1BALB/C8-AgP3-X63-Ag8.653P3.653BALB/C8-AgSP2/0-Ag14SP2/0BALB/C8-AgY3-Ag1.23Y3lou8-AgYB2-3.0-Ag20YB2(louA6)F18-Ag8-Ag:8-杂氮鸟嘌呤

6-TG：6－巯基嘌呤2、原因HGPRT¯或TK¯骨髓瘤细胞对HAT选择性培养基敏感。HAT培养液配方

成分浓度(mol/L)次黄嘌呤（H）1.010-4氨基蝶呤（A）4.010-7胸腺嘧啶核苷（T）1.610-5细胞由次黄嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸合成DNA的途径设计的3、原理根据DNA的主要合成途径阻断，利用补救途径合成DNA。

主要途径：氨基酸与一些小分子物

DNA合成质合成核苷酸，叶酸是重要的辅酶途径补救途径：利用次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷酸为前体

氨基蝶呤抑制二氢叶酸还原酶活性，阻断DNA的主要合成途径。死死死死活此时HGPRT¯或TK¯骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，在HAT培养基上培养，将会产生以下情况：HGPPT¯或TK¯瘤细胞B淋巴细胞HGPPT¯或TK¯瘤细胞HGPPT¯或TK¯瘤细胞B淋巴细胞B淋巴细胞B淋巴细胞HGPPT¯或TK¯瘤细胞（三）、两亲本细胞融合先用Hank’s液或无血清培养基洗涤两亲本细胞，以1～2：10（瘤细胞：B淋巴细胞）2500r/min弃上清轻敲细胞悬液加入1ml温育的50％PEG（1～2min）加入无血清培养基15ml

洗涤2次，加入20%的血清培养基

细胞培养37℃，5%CO2培养

添加HAT培养基换液（去1/3～1/2，加1/3～1/2）7天后

HT培养基14天后

普通培养基融合细胞

融合细胞经HAT培养基筛选后，并非所有杂交瘤细胞都分泌特异性抗体，产生抗体的细胞只占脾细胞的5％，因此要筛选阳性克隆细胞。(四）、融合细胞的筛选与克隆增加融合产生抗体的几率，常采用下方法：（1）将淋巴细胞培养于事先包被好抗原的培养板上，轻轻洗涤细胞，剩下的细胞用于融合（2）在选好的骨髓瘤细胞表面涂上抗原，用制备好的B淋巴细胞融合1、阳性筛选常用的方法是第二抗体法

免疫酶技术：用酶标记第二抗体免疫荧光技术：用荧光标记第二抗体放射免疫技术：用放射元素标记第二抗体例如：免疫酶技术筛选阳性克隆，即酶联免疫吸附试验（ELISA)1抗原抗体第二抗体（抗抗体）加杂交瘤上清液4度1h加辣根酶标记的第二抗体加酶作用底物显色3422、阳性细胞克隆化培养筛选出的阳性细胞有时不稳定，染色体易丢失，要尽早进行克隆化培养。方法如前（第4章）介绍。一般须经三次以上的克隆，才能达到100％孔均为特异抗体的阳性克隆细胞。3、抗体的纯化澄清和沉淀处理凝胶过滤，用sephadexG200作分离介质分离阴离子交换层析蛋白A亲和层析

（五）、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定1、染色体鉴定2、特征鉴定3、类别鉴定4、抗体纯度鉴定（六）、单克隆抗体的大量制备

体外法：在体外大规模培养杂交瘤细胞分离单抗，产量0.5～1ug/ml制备方法体内法：将杂交瘤接种于小鼠腹腔诱生大量腹水，腹水中含大量抗体，产量1～25ug/ml

五、人源性单克隆抗体的制备（报告）（一）、理由鼠源性单抗在人体中应用具有局限性如:注射鼠源性单抗，引起抗鼠反应，抗体很快被肌体清除，产生过敏反应，不能有效激发肌体免疫防御系统。需要寻找低免疫源性、高效的、人源性单抗是目前产生单抗的目标。（二）、制备人源性单抗的方法1、EB病毒转化技术即：在体外直接用EB病毒感染人外周血淋巴细胞，建立分泌抗体的人B淋巴细胞系。EB病毒就是epistein-barvirus，是epistein和bar1964年在非洲burkitt淋巴细胞中发现的类似于疱疹病毒的病毒颗粒缺点：转化效率低、克隆困难、转化细胞不稳定、抗体时有时无2、人－鼠杂交瘤单克隆抗体方法同鼠－鼠杂交瘤生产单抗技术缺点：用于人－鼠杂交瘤的亲本骨髓瘤细胞有限，杂交瘤不稳定，且多数情况下失去抗体分泌能力。3、人－人杂交瘤单克隆抗体优点:杂交瘤稳定，能分泌特异抗体。缺点：人骨髓瘤细胞有限。4、转基因动物生产单克隆抗体将人的免疫球蛋白基因转移到动物体内，产生人源性单抗。（三）、鼠源性单克隆抗体的改造改造目的：降低免疫源性降低相对分子量，增加组织通透性1、抗体的分子结构Ch2VhCh3

Ch1Cl1vl互补决定区互补决定区重链轻链-s-s--s-s--s-s--s-s-2、人－鼠嵌和抗体即：在基因水平上，将鼠源性单抗的V区基因与人的Ig的C区基因连接，再共转染骨髓瘤细胞，表达出人－鼠嵌和抗体。3、改型抗体用鼠源性单抗的CDR序列替换人Ig分子中的CDR序列。使人的Ig分子具有鼠源性单抗的抗原结合特异性。六、单克隆抗体的应用（文献报告）在医学中的应用（一）、诊断各种病原体如：用于诊断乙肝病毒、疱疹病毒、EB病毒以及各种微生物感染的试剂。（二）、检测淋巴细胞的表面标志如：对细胞表面抗原的检查在白血病患者的疾病分期、治疗效果、预后判断等方面有指导作用（三）、对机体微量成分的测定如：酶类、激素、维生素、药物等测定，对受检测者健康状态判断、疾病检出等具有指导意义。（四）、在肿瘤诊断中的作用以抗体为载体作为导向药物，现已制备出百余中单抗，鉴定出数十种与肿瘤抗原有关的抗原。将单抗用放射性核素标记，放射免疫显像可以在体内确切定位肿瘤，准确率达90％可检测出0.5cm大小的病灶小分子抗体更易到达肿瘤部位也可用于导向手术（五）、单克隆抗体作为靶向制剂将特异性抗体与抗癌药物相耦联例如：老年人常得脑血栓，动脉硬化等血管疾病，主要是