第三章酶反应动力学和第四章固定化酶1-4

第三章酶催化反应动力学（2学时）主要内容：

酶催化反应速率与酶活的测定1底物浓度对酶促反应速度的影响2酶浓度对酶促反应速度的影响3其它因素对酶促反应速度的影响5抑制剂对酶促反应速度的影响4酶催化反应动力学研究包括哪些内容?重要（1）底物浓度（2）酶浓度（3）抑制剂（4）温度（5）

pH影响因素（6）激活剂酶促反应速度目的和意义

找到适宜的反应条件提高或抑制酶催化反应效率

了解酶在生理代谢过程中的作用和某些药物的作用机制等定义：酶催化反应动力学是研究酶促反应速度以及影响此速度的各种因素的科学。1酶催化反应速率与酶活力的测定酶活力是指酶催化某一化学反应的能力，其大小可以用在一定条件下该酶所催化的某一化学反应的反应速度（reactionvelocity）来表示，酶活力的高低和化学反应的反应速度的大小两者呈线性关系。1.1酶催化反应速率随时间的变化酶催化的反应速度可用在单位时间内底物的减少量或者产物的增加量来表示。如图3-1所示的曲线图。酶促反应速度随反应时间延长而降低。图3-1酶促反应的速度曲线（1）底物浓度的降低、产物浓度增加从而加速了逆反应的进行；（2）产物对酶的抑制作用；（3）随着反应时间的延长引起酶的部分失活等。引起酶促反应速度随反应时间延长而降低的原因？测定反应初速度的方法来测定相关制剂中酶的含量（活性）。如何避免影响？1.2酶活力的测定原理酶蛋白的含量很低，很难直接测定其蛋白质的含量，且常与其他各种蛋白质混合存在，将其提纯耗时费力。故不能直接用重量或体积等指标来衡量。分光光度法荧光法同位素法电化学方法其他方法：如旋光法、量气法、量热法和层析法等测定酶活力常用的方法：测定酶活力的基本原理测定底物减少量测定产物增加量1.3酶活力测定时需注意：（1）选择反应的最适温度，根据不同的底物和缓冲液选择反应的最适pH。（2）速度要快，取反应的初速度（3）底物浓度要足够大（一般在10Km以上）使酶被底物饱和，以充分反映待测酶的活力2底物浓度对酶促反应速度的影响2.1中间络合物学说中间络合物学说最早是由Henri和Wurtz两位科学家提出的。在1903年，Henri在用蔗糖酶水解蔗糖实验研究化学反应中底物浓度与反应速度的关系时发现，当酶浓度不变时，可以测出一系列不同底物浓度下的化学反应速度，以该反应速度对底物浓度作图，可得到如图3-2所示的曲线。

图3-2底物浓度对酶促反应速度的影响根据这一实验结果，Henri和Wurtz提出了酶促化学反应的酶底物中间络合物学说。该学说认为：当酶催化某一化学反应时，酶(E)首先需要和底物(S)结合生成酶底物中间络合物即中间复合物(ES)，然后再生成产物(P)，同时释放出酶。该学说可以用下面的化学反应方程式来表示：

酶底物中间络合物学说E+Sk1k2k3ESE+P酶底物中间络合物学说酶还未被底物所饱和酶已全部被底物所饱和2.2酶促反应的动力学方程式（米氏方程）1913年Michaelis和Menten两位科学家在前人工作的基础上，根据酶促反应的中间络合物学说，推导出一个数学方程式，用来表示底物浓度与酶反应速度之间的量化关系，通常把这个数学方程式称为米氏方程：[S]：底物浓度

V：不同[S]时的反应速度Vmax：最大反应速度(maximumvelocity)Ｋm：米氏常数(Michaelisconstant)米氏常数Km的含义Km值就代表着反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。

。2＝Km+[S]

Vmax

Vmax[S]Km＝[S]Km值的推导：米氏常数的应用价值Km是酶的一个特征性常数：也就是说Km的大小只与酶本身的性质有关，而与酶浓度无关。Km值还可以用于判断酶的专一性和天然底物，Km值最小的底物往往被称为该酶的最适底物或天然底物。Km可以作为酶和底物结合紧密程度的—个度量指标，用来表示酶与底物结合的亲和力大小。已知某个酶的Km值，就可以计算出在某一底物浓度条件下，其反应速度相当于Vmax的百分比。

Km值还可以帮助我们推断具体条件下某一代谢反应的方向和途径，只有Km值小的酶促反应才会在竞争中占优势。米氏方程的双倒数作图双倒数作图法(doublereciprocalplot)，又称为林-贝氏(Lineweaver-Burk)作图法

Vmax[S]Km+[S]V=（林－贝氏方程）+1/V=KmVmax

1/Vmax1/[S]两边同取倒数-1/Km1/[S]1/V03酶浓度对反应速度的影响当[S]＞＞[E]，酶可被底物饱和的情况下，反应速度与酶浓度成正比关系式为：

V=K3[E]0

V

[E]

当[S]>>[E]时，Vmax

=k3[E]酶浓度对反应速度的影响

E+Sk1k2k3ESE+P4抑制剂对酶促反应速度的影响区别于酶的变性抑制剂对酶有一定选择性引起变性的因素对酶没有选择性酶的抑制剂(inhibitor)：凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂。（1）是研究酶的结构与功能、酶的催化机制以及阐明机体代谢途径的基本手段。（2）可以为医药产业中设计新药物和农业生产中设计新农药提供重要的理论依据。（3）在食品生产和保鲜中控制酶的催化效率。研究抑制剂的意义4.1抑制作用的类型及鉴别根据抑制剂与酶的作用方式的区别以及抑制作用是否可逆，我们可以将抑制作用分为两大类，即：不可逆的抑制作用(irreversibleinhibition)可逆的抑制作用(reversibleinhibition)鉴别不可逆抑制作用抑制剂与酶的必需基团以共价键的形式结合而引起酶活力降低或丧失。是不可逆的。本质上来说就是酶的修饰抑制可逆抑制作用由于抑制剂与酶以非共价键的形式结合而引起酶活力降低或丧失。是可逆的。鉴别方法（1）能否用透析、超滤和凝胶过滤等物理方法除去抑制剂？（2）化学动力学的方法（见下图）如何鉴别？图3-4可逆抑制剂与不可逆抑制剂的区别（一）曲线1，无抑制剂；曲线2，不可逆抑制剂；曲线3，可逆抑制剂4.2不可逆的抑制作用根据不可逆抑制剂选择性的差异，通常把不可逆抑制剂分为两种类型，即非专一性不可逆抑制剂和专一性不可逆抑制剂。①非专一性不可逆抑制剂有机磷化合物有机汞、有机砷化合物重金属盐烷化剂硫化物、氰化物和CO非专一性青霉素与丝氨酸羟基共价结合与半胱氨酸的巯基共价结合使酶蛋白变性与酶多个必须基团结合与酶中金属离子形成稳定络合物机理与糖肽转肽酶丝氨酸羟基结合举例1：有机磷化合物对羟基酶的抑制

有机磷化合物羟基酶解毒------解磷定(PAM)路易士气失活的酶巯基酶失活的酶酸BAL巯基酶BAL与砷剂结合物举例2：有机砷对巯基酶的抑制砷化合物巯基酶解毒------二巯基丙醇(BAL)②专一性不可逆抑制剂a) Ks型不可逆抑制剂：具有与底物相类似的结构例如：对甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲酮（TLCK）和胰蛋白酶的底物对甲苯硫磺-L-赖氨酰甲酯（TLME）具有相似化学结构b) Kat型不可逆抑制剂：不但具有与天然底物相类似的结构，而且抑制剂本身也是酶的底物，专一性极高，因此也被称为自杀性底物。例如：β-卤代-D-Ala是丙氨酸消旋酶的不可逆抑制剂4.3可逆的抑制作用根据可逆抑制剂与底物的关系，我们将可逆抑制作用分为三种类型。

竞争性抑制1非竞争性抑制2反竞争性抑制3①竞争性抑制(competitiveinhibition)：是最常见的一种可逆抑制作用。大多数竞争性抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。这种抑制作用称为竞争性抑制作用。其抑制程度取决于底物和抑制剂的相对浓度，可以通过增加底物浓度的方法来解除这种抑制作用。竞争性抑制反应模式在竞争性抑制中，底物(S)或抑制剂(I)与酶(E)的结合都是可逆的，因此存在着如下的化学平衡式：[S]>>[I]：高浓度的底物可解除抑制图3-5竞争性抑制曲线⑴Vm值不变，(表观）Km值增大；⑵Km随抑制剂浓度[I]的增加而增加；⑶双倒数作图所得直线相交于纵轴；⑷抑制作用可以被高浓度的底物减低以致消除。特点：与对氨基苯甲酸竞争性抑制二氢叶酸合成酶举例：磺胺类药物的抑菌机制②非竞争性抑制(noncompetitiveinhibition)：非竞争性抑制剂(I)和底物(S)可以同时与酶(E)结合，两者之间不存在竞争关系。但是在酶与抑制剂结合后，还可以进一步与底物结合形成酶-底物-抑制剂复合物ESI；酶与底物结合后，也可以进一步与抑制剂结合形成酶-底物-抑制剂复合物ESI。这种中间的三元复合物，即酶-底物-抑制剂复合物ESI不能进一步分解产生产物，因此相应的酶促反应速度下降。非竞争性抑制反应模式在非竞争性抑制中，抑制剂(I)与酶(E)或酶-底物复合物(ES)以及底物(S)与酶-抑制剂复合物(EI)的结合都是可逆的，因此存在着如下的化学平衡式：+

S－S+

S－S+ESIEIEESEP图3-6非竞争性抑制曲线⑴Vm值降低，Km值不变；Vm随[I]的增加而降低；⑵双倒数作图所得直线相交于横轴；⑶抑制剂对酶与底物的结合无影响，故底物浓度的改变对抑制程度无影响；抑制程度取决于抑制剂的浓度。特点：这类抑制最典型的例子是亮氨酸是精氨酸酶的一种非竞争性抑制剂。有某些重金属离子如Ag+、Cu2+、Hg2+、Pb2+等对酶的抑制作用也属于这一类。EDTA对金属酶的抑制。举例：③反竞争性抑制(uncompetitiveinhibition)：这类抑制作用的特点是只有在酶(E)与底物(S)结合后，才能与抑制剂(I)结合，形成酶-底物-抑制剂复合物ESI，与非竞争性抑制相似，这种中间的三元复合物，即酶-底物-抑制剂复合物ESI不能进一步分解产生产物，因此相应的酶促反应速度下降。反竞争性抑制反应模式反竞争性抑制的特点是，酶(E)必须先与底物(S)结合，然后才与抑制剂(I)结合，即抑制剂(I)与酶-底物复合物(ES)的结合是可逆的，因此存在着如下的化学平衡式：++ESESESIEP图3-7反竞争性抑制曲线⑴Vm值和Km值都随[I]的增加而降低；⑵双倒数作图所得为一组平行线；⑶必须有底物存在，抑制剂才能对酶产生抑制作用；抑制程度随底物浓度的增加而增加。特点：举例：这种抑制作用在单底物反应中比较少见，而常见于多底物反应中。目前已经证明，肼类化合物对胃蛋白酶的抑制作用、氰化物对芳香硫酸酯酶的抑制作用、L-Phe和L-同型精氨酸等多种氨基酸对碱性磷酸酶的抑制作用都属于反竞争性抑制。为了方便理解和记忆，我们现将无抑制剂和有抑制剂等不同情况下的米氏方程和Vmax及Km的变化总结归纳在表3-1中。总结：5其它因素对酶促反应速度的影响其它各种影响酶促反应速度的因素主要包括：温度、pH和激活剂等。5.1温度对酶促反应速度的影响温度对酶促反应的双重影响：一、当温度升高时，与一般化学反应一样，反应速度加快（Q10一般等于2）。二、温度升高随着温度逐渐升高，酶蛋白会因逐渐变性而失活）。图3-9温度对酶促反应速度的影响酶在固体状态下比在溶液中对温度的耐受力更高。酶的冰冻干粉制剂通常在冰箱中可存放几个月以上，而酶溶液一般在冰箱中只能保存数周。所以酶制剂以固体保存为佳。一般来说，动物细胞内的酶最适温度一般为35～40℃，植物细胞中的酶最适温度较动物细胞中稍高，通常在40～50℃之间，而微生物中的酶最适温度差别则较大，如用于进行PCR反应的TaqDNA聚合酶的最适温度可高达70℃。5.2pH对酶促反应速度的影响通常在一定pH下，酶会表现出最大活力，而一旦高于或低于此pH，酶活力就会降低，我们把表现出酶最大活力时的pH称为该酶的最适pH。在不同pH条件下进行某种酶促化学反应，然后将所测得的酶促反应速度相对于pH来作图，即可得到如图3-10所示的钟罩形曲线。图3-10pH对酶活力的影响pH影响酶活力的原因可能包括以下3个方面：(1)过酸或过碱使酶的空间结构遭到破坏，引起酶变性从而导致酶构象的改变、酶活性随之丧失。(2)pH影响了底物的解离状态或酶分子活性部位上有关基团的解离状态或酶-底物复合物的解离状态，而使底物不能与酶结合形成酶-底物复合物，或者形成酶-底物复合物后不能生成产物，使酶活性降低。(3)pH影响了与维持酶分子空间结构有关的基团解离，从而改变酶活性部位的构象，进而降低了酶的活性。与酶促化学反应的最适温度不同的是，各种酶在一定条件下都有其特定的最适pH，因此最适pH是酶的特性之一。但是酶的最适pH并不是一个常数，它受诸如底物种类和浓度、缓冲液种类和浓度等众多因素的影响，因此只有在一定条件下最适pH才有意义。4种pH-酶活性曲线绝大多数酶的最适pH在5～8之间，动物体内的酶最适pH多在6.5～8.0之间，植物及微生物中的酶酶最适pH多在4.5～6.5左右。但并不排除例外，如胃蛋白酶的最适pH为1.5，肝中精氨酸酶最适pH为9.7等等。5.3激活剂对酶促反应速度的影响与抑制剂相对的是，凡是能提高酶活性的物质都称为激活剂(activator)，而激活剂中大部分是无机离子或简单的有机化合物。无机离子

K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+及Fe2+

Cl-、Br-、I-、CN-、PO4-有机化合物EDTA可解除金属对酶的抑制半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、抗坏血酸对某些含巯基的酶有激活作用，保护酶分子中的巯基不被氧化激酶唾液淀粉酶一种激活剂只对某种酶起激活作用，而对另一种酶可能不起任何作用或起抑制作用。如对脱羧酶而言有激活作用的Mg2+对肌球蛋白腺三磷酶却有抑制作用；而对脱羧酶而言有抑制作用的Ca2+对肌球蛋白腺三磷酶却有激活作用。有时各种离子之间有拮抗作用如被K+激活的酶会受Na+的抑制，被Mg2+激活的酶会受Ca2+的抑制。有时金属离子的作用也可以相互替代如作为激酶的激活剂的Mg2+可被Mn2+所代替。激活剂的选择性第四章固定化酶和固定化细胞（2学时）主要内容：

1固定化酶的定义与优点

2酶固定化技术发展史

3固定化酶的制备方法

4固定化酶的特性

5固定化活细胞

6酶催化反应器及其类型游离酶的使用蒸汽→酶解罐简易图加热灭酶酶无法回收稳定性差1固定化酶的定义与优点所谓固定化酶(immobilizedenzyme)，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。固定化酶的优点：（1）同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用；（2）固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同时也省去了热处理使酶失活的步骤；（3）稳定性显著提高；（4）可长期使用，并可预测衰变的速度；（5）提供了研究酶动力学的良好模型。2酶固定化技术发展史

起始研究1916年系统研究1950年-工业化应用1969年-1916年，Nelson和Griffin将蔗糖酶吸附在骨炭粉上，吸附以后酶不溶于水且具有和液体酶同样的活性，实现了酶的固定化，可惜长期未得到重视。1953年Grubhofer和Schleith将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，然后将淀粉酶等与这种载体结合，制成了固定化酶。60年代后期，酶固定化技术迅速发展，出现了很多新的酶固定化方法。1969年，千畑一郎等将固定化氨基酰化酶应用于DL-氨基酸的光学拆分上，来生产L-氨基酸，开创了固定化酶应用于工业生产的先例。1973年，将固定化微生物细胞首次应用于工业生产。目前，固定化技术已经取得了许多重要成果，充分发挥了固定化酶和固定化细胞在改革工艺和降低成本方面的巨大潜力。但从目前的发展状况来看，尽管酶种类繁多，但已经固定化的酶却相对有限，采用固定化酶技术大规模生产的企业尚属少数，真正在工业上使用的固定化酶还仅限于葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶和青霉素酰化酶等为数不多的十几个酶种，故仍需大力研究开发使更多的固定化酶和细胞能适用于工业规模生产。应用现状：3固定化酶的制备方法酶的固定化方法主要可分为四类：吸附法、包埋法、共价键结合法和交联法。对于特定的目标酶，要根据酶自身的性质、应用目的、应用环境来选择固定化载体和方法。在具体选择时，一般应遵循以下6个原则。

（1）酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位，固定化时应采取尽可能温和的条件。（2）酶与载体必须有一定的结合程度，利于反复使用。（3）用于固定化的载体必须有一定的机械强度，不易破坏或受损。（4）固定化应尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高催化效率和产物的量。（5）所选载体应不和底物、产物或反应液发生化学反应。（6）固定化酶的成本适中，以利于工业使用。3.1吸附法吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法，是固定化中最简单的方法。酶与载体之间的亲和力是范德华力、疏水相互作用、离子键和氢键等。吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法。物理吸附法是通过物理方法将酶直接吸附在水不溶性载体表面上而使酶固定化的方法。是制备固定化酶最早采用的方法。常用的载体：纤维素、胶原、淀粉及面筋、活性炭、氧化铝、皂土、多孔玻璃、硅胶、二氧化钛、羟基磷灰石等。优点：操作简单、价廉、条件温和，载体可反复使用，酶与载体结合后，活性部位及空间构象变化不大，固定化酶活力较高。缺点：酶和载体结合不牢固，在使用过程中容易脱落，常与交联法结合使用。（1）物理吸附法离子吸附法(ionadsorption)是将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合的固定化方法，即通过离子键使酶与载体相结合的固定化方法。DEAE-纤维素吸附的α-淀粉酶、蔗糖酶已作为商品固定化酶。具有操作简便、条件温和、酶活力不易丧失等优点。此外，吸附过程同时可以纯化酶。（2）离子吸附法3.2包埋法包埋法是将酶包埋在高聚物的细微凝胶网格中或高分子半透膜内的固定化方法。前者又称为凝胶包埋法，酶被包埋成网格型；后者又称为微胶囊包埋法，酶被包埋成微胶囊型。（1）凝胶包埋法凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等合成凝胶或树脂。1-2%海藻酸钠+酶液EEEE5%CaCl2溶液（2）微胶囊包埋法微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的半透膜微胶囊内的方法。它使酶存在于类似细胞内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外的环境直接接触，从而增加了酶的稳定性。常用于制造微胶囊的材料有聚酰胺、火棉胶、醋酸纤维素等。适合于小分子为底物和产物的酶的固定化。如脲酶、天冬酰胺酶、尿酸酶、过氧化氢酶等。3.3共价键结合法共价键结合法(covalentbinding）是将酶与聚合物载体以共价键结合的固定化方法。酶蛋白上可供载体结合的功能基团有以下几种：（1）酶蛋白N末端的α-氨基或赖氨酸残基的ε-氨基。（2）酶蛋白C末端的α-羧基、天门冬氨酸残基的β-羧基以及谷氨酸残基的γ-羧基。（3）半胱氨酸残基的巯基。（4）丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羟基。（5）组氨酸残基的咪唑基。（6）色氨酸残基的吲哚基。（7）苯丙氨酸和酪氨酸残基的苯环。其中最普遍的共价键结合基团是氨基、羧基以及苯环。常用来和酶共价偶联的载体的功能基团有芳香氨基、羟基、羧基和羧甲基等。这种方法是固定化酶研究中最活跃的一大类方法，但必须注意，参加共价结合的氨基酸残基应当是酶催化活性非必需基团，如若共价结合包括了酶活性中心有关的基团，会导致酶的活力损失。用共价键结合法制备的固定化酶，酶和载体之间都是通过化学反应以共价键偶联。由于共价键的键能高，酶和载体之间的结合相当牢固，即使用高浓度底物溶液或盐溶液，也不会使酶分子从载体上脱落下来，具有酶稳定性好、可连续使用较长时间的优点。但是采用该方法时，载体活化的难度较大，操作复杂，反应条件较剧烈，制备过程中酶直接参与化学反应，易引起酶蛋白空间构象变化，酶活回收率一般为30%左右，甚至酶的底物的专一性等性质也会发生变化，往往需要严格控制操作条件才能获得活力较高的固定化酶。3.4交联法交联法（cross-linking）是使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互交联呈网状结构的固定化方法。由于酶蛋白的功能团，如氨基、酚基、巯基等参与反应，所以酶的活性中心构造可能受到影响，使酶明显失活。常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、异氰酸衍生物、双偶氮联苯和N,N′-乙烯双顺丁烯二酰亚胺等，其中使用最广泛的是戊二醛。戊二醛和酶蛋白中的游离氨基发生Schiff反应，形成薛夫碱，从而使酶分子之间相互交联形成固定化酶。以上四种固定化酶方法各有其优缺点（见表4-1）。往往一种酶可以用不同方法固定化，但没有一种固定化方法可以普遍地适用于每一种酶。在实际应用时，常将两种或数种固定化方法并用，以取长补短。4固定化酶的特性4.1固定化酶的形状固定化酶的形式多样，依不同用途有颗粒、线条、薄膜和酶管等形状。其中颗粒占绝大多数，它和线条主要用于工业发酵生产，如装成酶柱用于连续生产，或在反应器中进行批式搅拌反应；薄膜主要用于酶电极，应用于分析化学；酶管机械强度较大，亦宜用于工业生产。4.2酶活力固定化酶的活力在多数情况下比天然酶的活力低，其原因可能是：①酶活性中心的重