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文档简介

第三章兔血清效价检测（ELISA）1一、实验目的

了解酶联免疫吸附试验（Enzymelinkedimmunosorbent

assay,ELISA）的原理及优点，学习ELISA的操作过程。2二、原理

抗原－抗体反应的特异性

酶促反应的高效性3二、原理

酶标记抗体（或抗原）与固相载体上的相应抗原（或抗体）结合后，加入底物，酶催化底物出现颜色反应，颜色的深浅与抗原（或抗体）的量相关，用酶标仪测定其吸光值进行定量分析。4二、原理（间接ELISA检测抗体）A：包被抗原；B：加待检血清；C：加酶标二抗；D：加底物、显色；E：终止、读数ABCDE5二、原理

ELISA技术具有特异、敏感、结果判断客观、简便和安全等优点，在生物学及相关学科中应用广泛。6二、原理

本次实验以APP分泌到细胞外的天然毒素ApxIIA为检测抗原，包被酶标板，通过间接ELISA方法检测兔血清中针对APP毒素的抗体。7三、材料

1.酶标板：以ApxIIA天然毒素（抗原）包被的酶标板（每人一排）

2.洗涤液：1×PBST

3.封闭液：5％脱脂牛奶

4.待检样品：免疫兔血清（一抗）8三、材料

5.二级抗体：HRP标记的羊抗兔IgG；

6.显色液：TMB显色试剂（ELISA用）

7.终止液：1％SDS9四、操作步骤

1.加稀释液

在酶标板第1管加190µl洗涤液，2～11孔加100µl洗涤液，12孔加97.5µl洗涤液。

10四、操作步骤

2.稀释血清

在第一孔加待检血清10µl，混匀后取100µl到第二孔，依次稀释到第10孔，弃取100µl。

第11孔为空白，不加血清，第12孔加空白血清2.5µl，混匀。11四、操作步骤

3.温浴

稀释完成后，做好标记，将酶标板置于37℃反应30min。12四、操作步骤

4.洗板

取出96孔酶标板，甩去一抗液，每孔加洗涤液200µl，轻轻振荡1min，拍干，重复洗涤操作3次。13四、操作步骤

5.加二抗

在酶标板各孔加入HRP标记羊抗兔IgG（1:5000稀释）100µL，将酶标板置于37℃反应30min。14四、操作步骤

6.洗板

共洗涤5次。

7.加底物

在酶标板各孔加入TMB显色液100µl，避光室温静置10min。15四、操作步骤

8.加终止液

在各孔加终止液50µL。

9.读数

在630nm波长下以第11孔为空白调零后，读数。

16四、操作

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