第5章蛋白质结构与功能

第五章蛋白质的结构与功能

第一节活性蛋白质与前体第二节血红蛋白的结构与功能

第三节分子病第四节蛋白质分子进化第五节蛋白质变性第六节蛋白质与活性多肽的界限第一节活性蛋白质与前体

三、两类前体的不同功能二、酶与酶原一、激素与激素原一、激素与激素原一、激素与激素原（二）脑啡肽与前体（一）胰岛素与前体（一）胰岛素与前体

胰岛素原分子包含一条由81个氨基酸残基组成的多肽链。链内有3对二硫键。其化学结构如图5－l所示。

B链（l～30）在前、A链（61～81）在后，连接肽（C肽链）插在中间。即：H2N·B·C·A·COOH

在类胰蛋白酶及类羧肽酶B的催化下，从胰岛素原分子上切下Arg31、Arg32、Lys59以及Arg60四个残基，从而释放出C肽，产生了有生物活性的胰岛素（图5－2）。

C肽在胰岛素原分子中起何作用？有不同的意见。其中，一个比较合理的意见是：胰岛素一条链的结构是生物合成的需要，有利于使胰岛素的3对二硫键正确的配对。胰岛素原还有的前体，即前胰岛素原（preproinsulin）。通过一级结构测定查明，前胰岛素原与胰岛素原相比，在N端多出了一个肽段。此肽段称为信号肽（signalpeptide）。人前胰岛素原的信号肽其序列为：（二）脑啡肽与前体甲硫脑啡肽，其一级结构为Tyr·Gly·Gly·Phe·Met；亮脑啡肽，其一级结构为Tyr·Gly·Gly·Phe·Leu。脑啡肽结构与功能关系的一些规律1.Tyr1；以甲氧基取代酚羟基，则脑啡肽丧失镇痛活性，其N末端延长一个Arg，则活性下降。2.Gly2：改为D－Ala，则镇痛药效大大提高。这可能有助于β－转角的形成，与受体的结合，延长了半衰期。3.Gly3：为活性所必需，不能被取代。4.Phe4：可以被Trp、N－CH3·Phe取代，但不能被Tyr、Leu取代。5.Met5：去除，则活性下降，延长一个Thr，则活性不变。

二、酶与酶原表5－2酶原转变成活性酶

二、酶与酶原（二）胰蛋白酶原的激活（一）胰凝乳蛋白酶原激活（一）胰凝乳蛋白酶原激活

由245个氨基酸残基组成的，具有5对二硫键的一条多肽链，没有酶活性。当胰凝乳蛋白酶原的Arg15与Ile16之间的肽键被胰蛋白酶切开之后，才具有酶活性。这种酶称为π－胰凝乳蛋白酶。π－胰凝乳蛋白酶活性最高，但不稳定。

π－胰凝乳蛋白酶被其它π－胰凝乳蛋白分子作用（自身激活），切开Leul3－Ser14、Tyrl46－Thrl47以及Asnl48－Alal49间的肽键，释放2个2肽（Ser14－Arg15；Thrl47－Asnl48），产生稳定的但活性较低的α－胰凝乳蛋白酶

胰凝乳蛋白酶原α－胰凝乳蛋白酶催化部位Aspl02、His57、Ser195具有相同的取向。

Arg15－Ile16之间的肽键被切开之后，形成了新的Ile16N末端。这个新末端的氨基与分子内部的Asp194的羧基能形成盐键，从而使Ilel6的氨基质子化。这是使酶具有活性的重要条件之一。上述盐键的形成，引起一系列的构象变化：构象变化从而形成了一个能与底物的非极性侧链（芳香族氨基酸和Met的侧键）相结合的疏水的“口袋”。“口袋”的一面由189～192残基组成。这个结合部位（口袋）在酶原中是不存在的。它是结合底物的部位。酶分子中的Ser195和Glyl93的亚氨基能够与底物中敏感肽键的羧基氧同时形成氢键Met192从酶分子的内部转移到酶分子的表面；Gly187和Gly193更加伸展，构象变化（二）胰蛋白酶原的激活消化道中蛋白酶原激活的连锁反应三、两类前体的不同功能

现在看来，有两类前体。一类是前胰岛素原、前脑啡肽原、前甲状旁腺素原等那样的前体。其多肽链的N端区都有一个信号肽。表5－3列举了各种蛋白质前体的信号肽。信号肽与蛋白质的分泌直接相关另一类前体，如胰岛素原、脑啡肽原、各种蛋白酶的酶原以及血纤蛋白原、原胶原等，是调节生理功能，或者是形成特定构象所需要的。第二节血红蛋白的结构与功能

六、影响血红蛋白氧亲和力的因素五、S形氧合曲线的生理意义四、血红蛋白的变构效应三、血红蛋白对氧分子的结合二、血红蛋白分子结构一、概述

一、概述

血红蛋白（hemoglobin，简写Hb）存在于人和脊椎动物的红细胞中，是O2和CO2的运载工具。血红蛋白是最早得到结晶的蛋白质之一，是第一个与生理功能相联系的蛋白质，是第一个得到X射线衍射结构分析初步结果的蛋白质。从血红蛋白一级结构的研究中提出了分子病的概念；从血红蛋白与O2结合的研究中发现了协同效应。3种血红蛋白的亚基组成如下：HbA：α2β2HbA2：α2δ2HbF：α2γ2

成人的血红蛋白95％以上2％左右胎儿的血红蛋白70～80％二、血红蛋白分子结构

血红蛋白是一种球状的色素蛋白，分子量66，700，由珠蛋白和血红素结合而成。（三）血红素与珠蛋白结合（二）血红素结构（一）血红蛋白一、二、三、四级结构（一）血红蛋白一、二、三、四级结构血红蛋白（HbA）分子的α－亚基包含一条多肽链（称α－链），由141个氨基酸残基组成。β－亚基也包含一条多肽链（称β－链），由146个氨基酸残基组成。二者的一级结构如图5－9所示。为了比较，抹香鲸肌红蛋白的一级结构也列在图5－9中。各肽链之间氨基酸的排列有许多相似之处。例如：在α－链和β－键一级结构上，有

60个位置的氨基酸残基是相同的，占多肽链氨基酸残基总数的42%左右，α－链、β－链与肌红蛋白肽链(153AA)3者有23个位置的残基是相同的血红蛋白β－亚基三级结构血红蛋白β－链肌红蛋白构象比较血红蛋白分子是四聚体，包含2个α－亚基和2个β－亚基。相同的亚基分别配对。4个亚基按四面体方式排布。亚基之间凹凸互补，形成1个长、宽、高分别为6.4、5.5nm、5nm的四面体圆柱形片段是α－螺旋区。血红素以平盘表示。平盘中心的小球代表铁原子血红蛋白亚基之间的接触8个盐桥使脱氧血红蛋白分子构象受到了约束，使其对氧分子的亲和力低于单独的α－或β－亚基对氧分子的亲和力，低于氧合血红蛋白的氧亲和力此外，血红蛋白的四级结构中，在4个亚基之间有一个中央空穴。2，3－二磷酸甘油酸（DPG）位于这一空穴中。DPG分子中几个带负电荷的基团与每个β－亚基的几个带正电荷的基团相互吸引，产生几个盐桥,使脱氧血红蛋白分子的四级结构更加稳定，进一步降低了脱氧血红蛋白分子对氧分子的亲和力。

（二）血红素结构

在血红蛋白分子中每个亚基都包含1个血红素（heme）。血红素由1个铁原子和1个原卟啉组成。原卟啉的结构4个吡咯环次甲基桥连接铁原子的配位结合6个配位数（三）血红素与珠蛋白结合血红蛋白分子的每个亚基必须为血红素提供一个疏水性的空穴，以利于O2

能与血红素铁原子结合。与血红素结合的氨基酸残基三、血红蛋白对氧分子的结合

结合与解离，主要取决于氧分压在血液中，血红蛋白实际结合的氧分子数（或者已结合O2的氧结合部位数）对于血红蛋白应该能结合的氧分子数（或者氧结合部位数）的百分比，称为血红蛋白氧饱和度，用Y表示。

血红蛋白和肌红蛋白的氧结合曲线四、血红蛋白的变构效应

K1，K2，K3，K4分别为从上述各平衡公式可以得出：根据氧结合饱和度的定义，Y应该是：

当上述4个结合常数不相等时，也就是血红蛋白分子中4个亚基的氧结合部位之间存在相互作用时，则Y对[X]（用氧分压PO2表示）的关系表现为S形曲线但是，如果上述4个结合常数相等（k1=k2=k3=k4）时，也就是，血红蛋白分子中4个氧结合部位之间不存在相互作用时，则Y对[X]的关系如（2）式所示：这是双曲线。

因此，一般认为，在血红蛋白分子中，α－亚基首先与O2结合：O2引起α－亚基构象变化。此构象变化使相邻的β－亚基的构象亦发生变化，排除了β－亚基氧结合部位的空间位阻，从而提高了β－亚基对O2的亲和力。这种作用，就是变构效应，或称别构效应（allostericeffect）。许多蛋白质和酶都有变构效应。Adair模型、齐变（M.W.C.）模型和序变（K.N.F）模型

五、S形氧合曲线的生理意义肺氧分压10.664～13.33kPa80～100mmHg肌肉氧分压

2.666～5.332kPa20～40mmHg肌红蛋白的双曲线，可以设想：从肺[氧分压在10.664～13.33kPa（80～100mmHg）]到肌肉[氧分压在2.666～5.332kPa（20～40＝mmHg）]，氧分压虽然有较大的变化，但是，Y值变化不大。即到达肌肉后，氧合血红蛋白释放的O2不多。这就远远满足不了肌肉中生物氧化对于O2的大量需要。血红蛋白是有变构效应的。S形曲线的上部较平坦。当氧分压从13.33kPa（100mmHg）降到10.664kPa（80mmHg时（下降20mmHg），则氧结合饱和度（Y值）从0.95降到0.93（仅下降0.02）。这说明，在肺部，氧分压虽有较大的变化，但血液的氧饱和度没有多大改变。换句话说，存在较多的氧合血红蛋白。在肺部，要求血液中所有的脱氧血红蛋白尽量地结合更多的O2S形曲线的中段2.666～5.332kPa（20～40mmHg），坡度较大。当氧分压从5.332kPa（40mmHg）降到2.666kPa（20mmHg）时，下降［2.666kPa（20mmHg）］，则Y值从0.6降到0.3（下降0.3）。变化较大。这说明，在肌肉中，氧分压即使有很小的下降，血液中的氧饱和度亦有较大的下降。换句话说，在肌肉中，氧合血红蛋白能释放较多的O2。能满足肌肉等组织的生理需要。六、影响血红蛋白氧亲和力的因素

氧亲和力是指：血红蛋白对于氧结合的牢固程度，表示为PO250。即血红蛋白中的氧达到半饱和程度所需要的氧分压（PO2）。（一）H+和CO2的影响

（二）DPG的影响

（一）H+和CO2的影响

波尔效应：H+浓度和CO2分压的提高，能够降低血红蛋白分子对O2的亲和力促使氧合血红蛋白的氧解离曲线右移（右图）

在肌肉中，高浓度的H+和CO2促使氧合血红蛋白分子释放O2。在肺中，高浓度的O2促使脱氧血红蛋白分子释放H+和CO2。问题一：提高H+浓度为什么能够降低血红蛋

白对O2的亲和力？

实验表明，在脱氧血红蛋白分子中，H+的结合部位有：

α链N末端Val的－NH2基；β链His146的咪唑基；α链H122的咪唑基。

α链NA1Val的－NH2基与H+结合成带正电荷的基团（－NH3+）。后者与另一个α链的C末端－COO－基形成盐桥。

此外，H+还与β链His146的咪唑基结合成带正电荷的基团。后者再与同一链上βAsp94的侧链－COO－基生成盐桥。这些盐桥都有助于血红蛋白脱氧构象的稳定。因而，增加H+浓度会降低血红蛋白的氧亲和力。问题二：提高CO2分压为什么能够降低血红

蛋白对O2的亲和力？

在脱氧血红蛋白中，CO2的结合部位是4个亚基的N末端α－NH2基。CO2与N末端α－NH2基可发生下列可逆的反应：与氨基甲酸构成盐桥的基团可能是：β82（EF6）Lys的ε－NH3+基；α141（H24）Arg的胍基。

波尔效应具有下列重要的生理意义：

当血液流经组织时，与血液相比，组织的pH值较低，CO2分压较高，因而有利于氧合血红蛋白分子释放O2，使组织能比单纯的氧分压下降时获得更多的O2。当血液流经肺部时，由于肺气泡的O2分压较高，促进脱氧血红蛋白分子释放ＣO2和H+。CO2的呼出，有利于氧合血红蛋白的生成。（二）DPG的影响

DPG是红细胞中大量存在的糖代谢的中间产物。它能够降低血红蛋白对O2的亲和力，使血红蛋白的氧合曲线右移（图5－23）。

实验表明，DPG与脱氧血红蛋白的结合能力比氧合血红蛋白高100倍以上。因此，DPG是与脱氧血红蛋白结合的。

l个脱氧血红蛋白分子能够与一分子的DPG结合。

DPG分子与4个氧分子在脱氧血红蛋白分子上的结合，是互相排斥的。

DPG降低血红蛋白氧亲和力具有下列重要的生理意义：

▼当血液流经O2分压较低的组织时，红细胞中的DPG能促进氧合血红蛋白释放更多的O2，以满足组织对O2的需要。DPG的浓度越大，则O2的释放量越多。红细胞中DPG浓度的变化是调节血红蛋白分子对O2亲和力的重要因素。在空气稀薄的高山上的人，或者换气困难的肺气肿病人，其红细胞中的DPG代偿性增加，使为数不多的氧合血红蛋白分子尽量地释放O2，以满足组织对O2的需要。

第三节分子病一、概述二、镰刀状红细胞贫血症三、活性部位突变的血红蛋白四、三级结构突变的血红蛋白五、四级结构突变的血红蛋白一、概述

分子病是一种遗传性疾病。是指：由于DNA分子上的基因突变，而合成了失去正常生物活性的异常蛋白质，或者是缺失某种蛋白质，从而，影响了机体正常的生理功能而产生的疾病。基因突变包括下列几种类型目前，发现的异常血红蛋白，绝大多数属于单个氨基酸取代，即单个碱基取代、例如：异常血红蛋白S（HbS）和异常血红蛋白C（HbC）都是由于血红蛋白（HbA）β链上第6位的Glu发生了取代。在HbS中，变成Val；在HbC中，则变为Lys。单个碱基取代；一个或多个密码子的嵌入或缺失；基因连接；终止密码变异等。

按照分子遗传学的三联体密码理论，单个氨基酸取代是由于遗传密码上的单个碱基取代而产生的。如下图所示。

异常血红蛋白，除了个别氨基酸残基取代而外，还有一个或多个氨基酸残基的缺失，肽段的相互融合，肽链延长，甚至于整个肽链的缺失等。▼改换分子表面。在血红蛋白分子表面上的取代，绝大多数是无害的，但HbS等例外。▼改换活性部位。血红素附近的结构发生变异，影响了血红素对氧的结合。▼改换三级结构。氨基酸变异使多肽链不能折叠成正常的构象。这些异常血红蛋白通常是不稳定的。▲改换四级结构。在亚基之间界面上的突变，引起变构效应的丧失。这些异常血红蛋白通常具有异常的氧亲和力。

异常血红蛋白有下列几种类型二、镰刀状红细胞贫血症遗传性疾病，镰刀形红细胞血红蛋白（HbS）比正常的红细胞脆弱，易破碎，寿命较短

问题一：HbS与正常的血红蛋白（HbA)在结构与性质上有哪些区别？

HbS比HbA多2～4个正电荷。HbS的等电点（6.91）比HbA的等电点（6.68）大0.23。在pH8.0缓冲系统中电泳，HbS的电泳速度较慢。脱氧HbS的溶解度很低，约为脱氧HbA的1／25。HbS的浓溶液，脱氧后会形成纤维状沉淀。这个沉淀使红细胞由扁圆形变成镰刀形。

暴露于血红蛋白（HbA）分子表面的是极性氨基酸残基。在人类以及各种动物的血红蛋白之间，分子表面的氨基酸残基有明显的差异。说明这部分的氨基酸容易变异，它们对于血红蛋白的功能不是关键性的。已发现一百多种在分子表面发生氨基酸取代的异常血红蛋白。这些取代，绝大多数不影响血红变白分子的稳定性及功能。因此，在临床上，它们是无害的。只有一小部分异常血红蛋白可以引起临床症状，例如：HbS、HbC、HbE、HbI以及HbKIbadan等。

问题二：HbS为什么能引起临床症状？

在β链第6位，用Val取代Glu，就是把一个非极性残基放在HbS分子的表面。这种改换明显地减小了脱氧HbS的溶解度，但对氧合HbS的溶解度很少影响。这个事实对理解镰刀状红细胞贫血症的临床症状是很关键的。

镰刀形化的分子基础可以设想如下：

1．用Val取代Glu，使HbS每个β亚基的外侧产生了一个粘斑（图5－26）。这个粘斑在脱氧和氧合HbS分子中都有，但HbA上没有。

2．在脱氧HbS上有一个与粘斑互补的部位，脱氧HbS形成细长的聚合体，即一股螺旋纤维。3.几股螺旋纤维缠绕在一起，就形成了在电镜下可见的直径为17nm和21.5nm的两种纤维三、活性部位突变的血红蛋白HbM发现于世界各地区和各种族。通过血红蛋白的结构分析，发现其氨基酸取代有下列5种类型（表5－6）血红蛋白M类型先天性青紫症状以及继发性的红细胞增多，称为HbM病与血红素结合的氨基酸残基四、三级结构突变的血红蛋白Pro是α－螺旋的破坏者。如果Pro取代螺旋段中的氨基酸残基，则血红蛋白分子构象便发生严重的扰乱，从而产生不稳定的血红蛋白和CHBHA。有许多不稳定的血红蛋白，就是由于Pro取代了螺旋段中的氨基酸残基而产生的。例如：HbDuarte是β－链的螺旋段E6的Val62被Pro取代而产生的；HbGenoa是β－链的螺旋段B10的Leu28被Pro取代而产生的。β－链α－螺旋段B5缺失一个Val23β链非螺旋拐角区F7～FG2缺失了一个肽段[Leu（91）－His－Cys－Asp－Lys（95）]五、四级结构突变的血红蛋白

在氧合血红蛋白与脱氧血红蛋白互相转变时，血红蛋白分子的四级结构发生了改变，在α1β2（或α2β1）的接触处两条肽链发生明显的前后位移（图5－20）。属于这类血红蛋白的有：HbYakima：β99（G1）Asp→His；HbKempsey：β99（G1）Asp→Asn；HbRadcliffe：β99（G1）Asp→Ala等。β102（G4）Asn如果发生取代，则破坏氧合状态构象的稳定性，使血红蛋白的氧亲和力降低。例如HbKansas：βl02（G4）Asn→Thr。在亚基之间界面上的突变，引起血红蛋白变构效应的丧失，出现异常的氧亲和力。第四节蛋白质分子进化

一、概述二、细胞色素C分子的进化

（一）细胞色素c一级结构的种属差异（二）细胞色素C三级结构的保守性

一、概述关于不同种属生物的功能相同的蛋白质分子，其一级结构有种属差异。蛋白质分子的三维结构，特别是关键部分，不能因为变异而受到严重影响。同源蛋白：指由共同的祖先分子经过变异和自然选择而产生的功能上相同、相关或不同，但结构上有相似的不同蛋白质。3.在同源蛋白的进化过程中，氨基酸残基之间的置换有下列规律：残基侧链的大小、形状、柔性、电荷以及氢键形成能力等愈近似，则置换愈易发生，例如：Lys置换为Arg，Ile置换为Leu等。4.同源蛋白在进化过程中，其三维结构的关键部位是守恒的，尤其是活性部位（包括与金属辅基或辅酶相结合的位置）的氨基酸残基及其三维排布，均不会发生改变。5.蛋白质分子的疏水核，其疏水作用对维持蛋白质分子构象有重要的作用。6.蛋白质分子在进化过程中，某些功能能够得到完善，或者新的功能能够产生。7.同源蛋白的进化有两个趋势：一个是保全与完善其生物功能；另一个是产生新的生物功能，即功能异化。（一）细胞色素c一级结构的种属差异

现在，已测出近百种生物的细胞色素C的一级结构。表5－7列举了38种生物的细胞色素C一级结构。

脊椎动物的细胞色素C都是由104个（个别的103个）残基组成的，但昆虫的有108个残基，植物的有111－114个残基（一般为112个）。表5-8细胞色素C的种属差异量

（以人为标准）细胞色素C的种属差异量（A）及进化树（B）（二）细胞色素C三级结构的保守性

图5-32两种不同种属的细胞色素C三维结构的比较细胞色素C三级结构的保守性1.对于生物功能最重要的结构部位是最保守的。血红素是细胞色素C分子的电子传递中心，在生物进化过程中保持不变。马心细胞色素C分子构象Cys14、Cysl7

、His18

、Met80

、Tyr48、Trp59、6个残基保持不变。乙烯基共价相连

Fe原子配位键相连丙酸基氢键相连2.不同物种的细胞色素C的狭缝区域，其疏水性残基一般是守恒残基，或者是可以保守性取代的残基环绕狭缝周围的是16个疏水性氨基酸残基。l～47位氨基酸残基分布于血红素的一侧48～91位氨基酸残基分布于血红素的另一侧16个疏水性氨基酸残基：6个Leu（32，35，64，68，94，98），3个Ile（81，85，95）；2个Pro（30，71），2个Phe（10，46），2个Tyr（48，67），l个Trp（59）。狭缝的结构严格地决定着整个细胞色素C分子的三维结构保守性取代所谓保守性取代是指：化学性质相似的氨基酸残基之间有相互置换的现象。例如：Leu与lle，Val与Ile，Phe与Tyr，Asp与Glu之间都能互相替换。70～80肽段中的11个残基都是守恒残基。它们参与构成血红素的疏水环境，对于细胞色素C的功能可能十分重要。3.多肽链方向发生改变的拐弯处，对于保持分子构象的形状十分重要。

位于拐弯处的Pro（30，71，76）以及Gly（29，34，45，77，84）必然是守恒残基。

血红素与环境之间有两个通道。血红素与环境之间的两个通道左通道是由52～74肽段盘绕而成的。通道中有3个疏水性的守恒残基：Trp59、Tyr67、Tyr74。可能是电子传递通道右通道使血红素的右侧能与环境相通。是一个带正电荷的区域4.在分子背部的上方，有一个带负电的区域。在分子的右上方及左通道的口部，是一个带正电荷的区域分子背部的上方的带负电的区域包括2，4，61，62，66，69，90，93号残基。它们都是可变的残基。大多数都是带负电的在进化过程中，该区域保持带负电不变分子的右上方的带正电荷区域由5，7，8，13，25，27，99，100等残基围成右通道，使血红素的右侧能与环境相通。允许种属差异左通道的口部带正电荷的区域

39，53，55，73，79，86，87。它们围绕左通道的口部，成一环形，允许有种属差异第五节蛋白质变性一、概述二、各种变性因素对蛋白质构象的影响三、变性蛋白质的构象四、变性和复性五、变性的预防和利用

一、概述（一）变性概念（三）变性现象（二）变性因素（四）蛋白质变性的鉴定方法（五）研究蛋白质变性的重要意义（一）变性概念由于外界因素的作用，使天然蛋白质分子的构象发生了异常变化，从而导致生物活性的丧失以及物理、化学性质的异常变化。变性可以涉及次级键、二硫键的断裂，但不涉及一级结构上肽健的断裂。（二）变性因素一类是化学因素酸、碱，有机溶剂（如：乙醇、甲醇、丙酮、乙醇等），尿素、盐酸胍，表面活性剂（如：十二烷基硫酸钠等），以及三氯乙酸、磷钨酸、水杨酸等另一类是物理因素热（60～70℃），紫外线、X射线、超声波、高压、表面张力以及剧烈的振荡，研磨、搅拌等

（三）变性现象1.物理性质的改变

溶解度下降，有的甚至于凝集、沉淀；失去结晶的能力；出现流动双折射现象；特性粘度增加；旋光值和椭圆度改变，以及紫外吸收光谱和荧光光谱发生变化等

酶水解增强

化学反应增多抗原性改变；生物功能丧失

3.生物性能的改变2.化学性质的改变（四）蛋白质变性的鉴定方法1.测定蛋白质的比活性2.以天然蛋白质作对照，测定蛋白质物理性质的变化。3.测定蛋白质化学性质的变化。4.用免疫法测定蛋白质的抗原性是否改变，抗体能否与抗原专一性结合。5.观察蛋白质的溶解度是否下降，是否凝集、沉淀等。

（五）研究蛋白质变性的重要意义

1.大多数从事蛋白质和酶制剂研究的人，希望通过变性研究，认识并掌握变性条件、防止变性，以得到高活性的蛋白质和酶制剂。2.有些研究工作，需要利用变性条件。3.利用变性过程，研究维持蛋白质二、三、四级结构的作用力，研究各种作用力在决定活性部位上的作用。二、各种变性因素对蛋白质构象的影响（一）温度的影响（二）酸、碱的影响（三）尿素和盐酸胍的影响（四）表面活性剂的影响（五）有机溶剂的影响（六）盐的影响（一）温度的影响热变性。热变性有可逆和不可逆之分，一般来说，热变性仅仅涉及次级键的变化。温度升高使分子内的振动增强，从而破坏了维系空间结构的次级键，使蛋白质变性。

冷钝化RNA酶在低pH范围（1.13～3.15）内的可逆热变性曲线△ε是相对天然蛋白的消光系数变化在低温下，一些酶被冷钝化。其中，有些酶的冷钝化是不可逆的。但是，大多数酶的冷钝化是可逆的。固氮酶的铁蛋白，在0～1℃下放置

15小时，就丧失了固氮活性，在重新加温到最适温度时，不能恢复固氮活性。；丙酮酸核化酶在

0℃

放置一小时之后，几乎完全丧失活性，然后，保温

30分钟，几乎完全恢复活性。多亚基的蛋白质发生这类变化并不少见。烟草花叶病毒（TMV）外壳蛋白（鞘蛋白）亚基的聚合，随温度下降而降低。冷钝化可能与酶的活性寡聚体解离成无活性的亚基有关。

（二）酸、碱的影响在多肽链的不同部位，存在着酸性氨基酸残基和碱性氨基酸残基。因而，在多肽链的不同部位的侧链基团之间，存在着静电的相互作用在许多情况下，酸、碱变性，是与埋藏在蛋白质分子内部的未电离的侧链基团（主要是Tyr，His）有关的。当pH超过该基团的pK值几个pH单位时，这些基团就发生电离，而带上电荷。由于同性电荷相斥，使多肽链伸展，结果，这些基团便转移到分子表面上。酸、碱所引起的蛋白质构象的变化，有大小之分。有的是很小的变化；有的则几乎变成无规则卷曲；有的则是无序和有序两部分同时并存的。（三）尿素和盐酸胍的影响尿素（脲）和盐酸胍是常用的蛋白质变性剂。下图表示了β－乳球蛋白（β－lactoglobulin）的脲变性曲线。

β－乳球蛋白的脲变性曲线实验条件：25℃，pH2.77，离子强度0.15，在365nm波长测定旋光率－[α]；在－[α]=－310℃时的平线相当于蛋白质完全伸展的构象

脲、胍使蛋白质肽链伸展而暴露出内部的巯基，巯基之间生成二硫桥，进而凝集和沉淀；脲、胍处理，使蛋白质形成稳定的链间非共价键，从而使蛋白质凝集或沉淀脲、胍与蛋白质生成氢键的能力比水分子强；它们可以通过破坏蛋白质分子内的氢键而使蛋白质变性脲、胍能增加非极性分子（包括非极性氨基酸）在水中的溶解度，从而将疏水效应减少1／3。这可能是脲，胍影响水结构性质的间接结果。由此推测，脲、胍很可能通过破坏蛋白质分子内部的疏水作用，从而使蛋白质分子伸展。此外，脲、胍也可能与蛋白质分子的折叠态和伸展态直接作用，产生各种效应。

（四）表面活性剂的影响长链的脂肪酸（如月桂酸）或相应的表面活性剂（SDS）很容易与蛋白质结合，使蛋白质变性。与脲、胍不同，这类变性剂不需要高浓度，在很低的浓度下，就能与蛋白质高度的结合。大多数蛋白质与

SDS结合的比例很相似，而且，结合的比例是溶液中自由

SDS平衡浓度的函数

各种蛋白质与SDS结合的比例是溶液中自由SDS平衡浓度的对数的函数十六烷基三甲基溴化物（cetyltrimethylammoniumbromide）是带正电荷的；异辛烷基苯氧基多乙氧基－乙醇（isooctoylphenoxypolyethoxyethanol，又称TritonX－100）是中性的。这两种表面活性剂也用来解离蛋白质四级结构，或者，用来从生物膜中脱下膜蛋白．中性表面活性剂也经常用来对病毒进行温和的破碎。（五）有机溶剂的影响对蛋白质来讲，一般把非水溶剂分成两大类：强质子性溶剂和弱质子性溶剂。强质子性溶剂主要是有机酸和有机碱。弱质子溶剂主要是一些醇和酰胺。一般认为，有机溶剂可以影响静电力，氢键和疏水作用，从而导致蛋白质的构象变化，主要表现为螺旋度的增加。

（六）盐的影响不同的盐对蛋白质的构象有不同的影响。例如：对于RNA酶构象的稳定性，有些盐（如：KSCN，CaCl2）有降低作用；有些盐（如：（NH4）2SO4）有提高作用；有些盐（如：NaCl、KCl）没有作用（下图）。各种盐对RNA酶解链温度（Tm）的影响所有的溶液含有：5mg／mlRNA酶，0.15mol／KCl；0.013mol／