人教版选修一专题五课题三血红蛋白的提取和分离(共33张PPT)

1、含量：占细胞干重的50％以上，是细胞中含量最多的有机化合物。2、组成元素：C、H、O、N3、基本单位：氨基酸蛋白质小知识氨基NH2COOH羧基HR—C—4、分子结构：氨基酸多肽蛋白质肽键：—CO—NH—5、相对分子质量：高分子化合物蛋白质小知识脱水缩合盘曲折叠1、分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。2、蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附的性质和对其他分子的亲和力，等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。思考凝胶色谱法（分配色谱法）1、概念：根据被分离物质（如蛋白质）相对分子质量的大小，利用具有多孔网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。性质：微小的多孔球体本质：多糖类化合物实例：葡聚糖、琼脂糖凝胶色谱法分离蛋白质凝胶色谱法（分配色谱法）2、原理：

当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。相对分子质量大小直径大小大于凝胶颗粒孔道直径小于凝胶颗粒孔道直径运动路径被阻挡在凝胶颗粒外面而迅速通过因扩散进入凝胶颗粒内部而被滞留运动速度较快较慢运动路程较短较长洗脱次序先后缓冲溶液1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的溶液。2、作用：能够抵制外界的酸或碱的对溶液的pH的影响，维持pH基本不变。3、配制：通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。还记得人体血液中的缓冲液吗？H2CO3/NaHCO3

NaH2PO4/Na2HPO4你认为在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是什么？目的是什么？本实验使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和科学研究（活性）。电泳1、概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2、原理：①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。3、类型：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳应用：测定蛋白质分子量、进行蛋白质纯度鉴定原理：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。SDS：消除净电荷对迁移率的影响。电泳用SDS测定蛋白质分子量的方法

使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A电荷的多少B分子的大小C肽链的多少D分子形状的差异

在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动琼脂糖凝胶电泳示意图电泳检测结果琼脂糖凝胶电泳实验操作步骤样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定

水分血浆固体物质血液白细胞血细胞血小板红细胞血红蛋白（90％）血红蛋白的组成β

βα

α血红素基因可携带一分子O2或一分子CO23.用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？

鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。1、红细胞的洗涤2、血红蛋白的释放3、分离血红蛋白溶液4、透析（一）样品处理问题：1、刚采集的血样要做怎样的处理？为什么？加入抗凝血剂，防止血液凝固。2、怎样洗涤？采样分离－吸浆倒红－加液搅拌－重洗三次低速短时间离心生理盐水1、红细胞的洗涤②洗涤操作：1、采集血样。2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤。5、低速离心（低速短时间）6、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。3、洗涤的目的是什么？去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。4、洗涤干净的标志是什么？直至上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净。1、红细胞的洗涤2、血红蛋白的释放问题：加蒸馏水和甲苯的作用是什么？使红细胞破裂，释放出血红蛋白。

加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液：

①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min。②试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。③分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。有机溶剂（无色透明的甲苯层）脂类物质（白色脂溶性物质沉淀层）血红蛋白溶液（红色透明液体）红细胞破碎物沉淀（暗红色沉淀物）3、分离血红蛋白溶液高速离心－滤纸过滤－漏斗分液(4)透析：

①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。

②透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。该结果说明什么？

原理：透析袋（半透膜）能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。

透析法（二）凝胶色谱操作1、凝胶色谱柱的制作打孔→挖穴→安管→覆网→纱包→插管2、凝胶色谱柱的装填固定色谱柱→配凝胶悬液→装填色谱柱→洗涤平衡3、样品的加入和洗脱调节缓冲液面→滴加透析样品→样品渗入凝胶床→洗脱→收集分装蛋白质2.凝胶色谱操作:（1）凝胶色谱柱的制作：

①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。2、凝胶色谱柱的装填固定色谱柱－配凝胶悬液－装填色谱柱－洗涤平衡磷酸缓冲液沸水浴加热紧密

(pH为7.0)不得有气泡（二）凝胶色谱操作（2）凝胶色谱柱的装填①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶,浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。

④洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。（2）凝胶色谱柱的装填50cm高注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。装配好的凝胶柱3、样品的加入和洗脱调节缓冲液面→滴加透析样品→样品渗入凝胶床→洗脱→收集分装蛋白质磷酸缓冲液(1)不要触及破坏凝胶面(pH为7.0)(2)贴壁加样

(3)使吸管管口沿管壁环绕移动（二）凝胶色谱操作（3）样品加入与洗脱①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。

②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。

③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。

④洗脱：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）

（3）样品加入与洗脱注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。思考下面的问题：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能正常。1、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？2、与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特点对你进行血红蛋白的分离有什么启示？血红蛋白是红色的，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。蛋白质的提取和分离步骤1、样品处理通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集血红蛋白溶液。2、粗分离经过透析去除分子量较小的杂质。3、纯化通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白质除去。4、纯度鉴定通过SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定。（三）SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）2.试剂的配制：鉴定血红蛋白纯度。1.目的：3.方法步骤：（略）收集得到的纯化后的血红蛋白练习巩固：1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是（）A弄清各种蛋白质的空间结构B弄清各种蛋白质的功能C弄清各种蛋白质的