细胞表面分子的检测与分析

本次实验课流程课件讲述40min实验演示20min流式细胞仪硬件及软件介绍30min上机检测40min解惑答疑15min流式样本制备武汉大学医学研究中心柳卫凰流式在细胞表面分子检测中的应用免疫细胞及其亚群的检测与功能分析例如：T细胞、B细胞、NK细胞、DC细胞等血液系统细胞表面标志的研究例如：急性白血病的初步诊断与检测、CD34+造血干细胞研究、 血小板分析辅助诊断相关疾病等细胞群体及细胞表面标志变化的监测例如：测定因试验或临床治疗引起的某些细胞表面标志的变化细胞表面标志构成性质的分析例如：蛋白、糖蛋白、类脂结构、性质、比例的分析标本来源实体组织新鲜组织、石蜡包埋样本骨髓穿刺液

体液、灌洗液外周血全血溶血、PBMC培养的细胞

原代细胞细胞系：贴壁细胞、悬浮细胞

一、新鲜实体组织样本的制备酶消化法。常用的酶类试剂：胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶等机械法。1、剪碎法2、网搓法3、研磨法化学处理法。常用试剂：0.2%EDTA0.25%胰酶+0.2%EDTA注意：除消化过程外，其余步骤最好在4℃环境下操作，提高细胞活性。标本制备

标本制备二、全血标本的制备

“ABC”溶血（Beckman）取肝素钠抗凝的外周血100ul，荧光标记完成后，依次加入A液600ul，轻轻振荡15s；B液260ul,轻轻振荡15s；C液100ul,振荡10s，免洗上机检测。

“ACK”溶血（自配）

以1：3的比例取肝素钠抗凝的外周血与ACK溶血剂混匀，室温放置10min，离心去上清，再加入溶血剂溶血，反复2～3次，至红细胞完全溶解。细胞重悬后，再进行荧光标记。标本制备三、外周血单个核细胞的制备（1）取外周血2ml，肝素抗凝，生理盐水稀释成4ml，混匀；（2）将装有4ml淋巴细胞分离液的试管倾斜45度，沿试管壁缓慢加入稀释血液，勿用力过大；（3）离心2000r/min，20min，离心后分层，上层为血浆层，中层为分离液层，底层为红细胞层；（4）用吸管将上层与中层之间的单个核细胞层吸出，用生理盐水洗两遍，PBS重悬；（5）荧光标记。四、贴壁细胞单细胞悬液的制备（1）将培养细胞用0.04％EDTA或0.25％胰酶消化3～7分钟，至光镜下见到贴壁细胞变圆还没有漂浮为止，弃消化液，加PBS；（2）用吸管将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来，移入离心管中；（3）离心，1000r/min，5min；（4）加PBS洗两遍；（5）PBS重悬，将细胞吹打均匀；（6）荧光标记。标本制备标记方法直接免疫荧光法

特点：操作简单、省时；特异性强；结果判断较简单。间接免疫荧光法

特点：适用范围广；抗体相对便宜；操作费时；易产生非特异性染色，结果不易判断。（建议只用于单标检测）直接、间接混合染色法

染色原则：一般情况下先间接后直接，特殊情况下可先直接标记。推荐！对照设置阴性对照调节荧光探测器放大倍数，确定带测标本的基础荧光域值。常用的有：同型对照、封闭抗体对照、阴性细胞对照阳性对照检测抗体特异性或确定实验方法的稳定性、准确性。空白对照

确定待测标本的基础荧光域值或检测染色方法是否成功。补偿对照

多色荧光标记时，用于荧光光谱重叠的调节。同型对照（IsotypeControl）用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面的Fc受体而产生的背景染色与染色的单克隆抗体①相同种属来源②相同免疫球蛋白及亚型③相同荧光素标记④相同剂量和浓度⑤由未免疫动物血清纯化而来双色标记荧光补偿口诀：横平竖直荧光补偿对照分析类型管功能加入的抗体单色分析1Isotypeγ1-FITC2Sample1,2……A-FITC双色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PE2Compensation1A-FITCγ2a-PE3Compensation2γ1-FITCB-PE4Sample1,2……A-FITCB-PE三色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PEγ1-PC52Compensation1A-FITCγ2a-PEγ1-PC53Compensation2γ1-FITCB-PEγ1-PC54Compensation3γ1-FITCγ2a-PEC-PC55Sample1,2……A-FITCB-PEC-PC5四色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PEγ1-ECDγ1-PC52Compensation1A-FITCγ2a-PEγ1-ECDγ1-PC53Compensation2γ1-FITCB-PEγ1-ECDγ1-PC54Compensation3γ1-FITCγ2a-PEC-ECDγ1-PC55Compensation4γ1-FITCγ2a-PEγ1-ECDD-PC56Sample1,2……A-FITCB-PEC-ECDD-PC5注意事项样本的采集、储存样本的染色全血样本的溶血效果流式实验对照的设置样本的采集手术切除的新鲜标本取材时，要避免出血或组织坏死。深低温保存，以免组织发生自溶，DNA降解，造成检测结果的误差。采集静脉血样本时，要避免发生溶血。收集培养的细胞时，要注意选择消化的方法和试剂。样本的储存原则：时间越短越好肝素抗凝的外周血和骨髓：室温≦72小时EDTA抗凝的标本：室温≦

24小时ACD抗凝的外周血：室温≦

72小时ACD不推荐用作骨髓穿刺液的抗凝粒细胞、血小板功能检测：即刻检测单核细胞表面抗原分析：≦1小时，4℃嗜酸性粒细胞表面抗原分析：≦24小时，4℃淋巴细胞免疫表型与DNA含量的分析：≦72小时样本的染色影响抗原抗体反应的因素

电解质、反应温度与时间、PH值（7.2～7.4）流式抗体的选择

根据流式细胞仪的类型选择抗体抗体应用级别、滴度和使用量的选择根据抗原表达量选择抗体溶血，即裂解红细胞。它是流式细胞术分析白细胞的先决条件。溶血不好，白细胞群不能很好分开，溶血好坏直接影响检测结果。因此，必须对溶血过程进行严格控制。

全血样本：溶血效果很重要影响溶血的因素：采血过程溶血剂的使用实验操作过程结语流式细胞术的样本制备没有一个黄金标准最佳样本制备方法需要根据具体情况独立设定评估常用的荧光染料荧光染料激发波长(nm)发射波长(nm)用途颜色

FITC488525免疫荧光绿色

PE(RD1)488575免疫荧光橙色

ECD488620免疫荧光橙红

PeCy5488675免疫荧光红

PI488620DNA染色橙红

PECy7 488 755 免疫荧光深红

PerCP 488 670免疫荧光深红参考书籍《实用流式细胞术彩色图谱》王书奎主编《流式细胞术基本原理与实用技术》梁智辉主编《临床流式细胞分析》王建中主编《流式细胞术》杜立颖主编实验：人外周血T淋巴细胞亚群的

检测与分析淋巴细胞单核细胞粒细胞这三群细胞分别由具有不同功能的细胞组成这些细胞数量不等，甚至非常稀少这些细胞表达不同的标记物，是用来区分它们的基础T淋巴细胞(CD3+)名称功能CD3+CD4+辅助性/诱导性T细胞(Th/Ti)辅助和诱导细胞免疫和体液免疫CD3+CD4+CD29+CD3+CD4+CD29-辅助性T细胞(Th)诱导性T细胞(Ti)辅助细胞免疫和体液免疫诱导细胞免疫和体液免疫CD3+CD8+抑制性/杀伤性T细胞(Ts/Tc)抑制免疫反应/杀伤异源细胞CD3+CD8+CD28-CD3+CD4+CD29-抑制性T细胞(Ts)杀伤性T细胞(Tc)抑制细胞和体液免疫细胞毒性T细胞CD3+CD4+CD8+活化的T细胞在T细胞恶性增生时升高CD3+CD4-CD8-有调节功能的T细胞,其表达/T细胞受体(TCR/)CD4+/CD8+比值CD45RA+CD45RO-幼稚的/静止的T淋巴细胞当免疫系统没有能力更新辅助性或抑制性/细胞毒性淋巴细胞的祖细胞时此细胞亚群较低CD45RA-CD45RO+记忆性T淋巴细胞病菌感染时升高,但在慢性病毒感染,如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+活化的T细胞,感染时升高感染时升高活化T淋巴细胞名称功能CD3+HLA-DR+活化T细胞CD4+HLA-DR+活化的辅助性/诱导性T细胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/杀伤性T细胞CD4+CD25+活化的辅助性/诱导性T细胞CD8+CD25+CD8+CD38+HLA-DR+活化的抑制性/杀伤性T细胞在病毒感染的患者中增加;其增加意味着HIV患者的预后较差B淋巴细胞(19+)CD19+CD23+活化的B细胞过敏患者中升高CD19+CD5+在自身免疫性疾病中升高CD19+CD5+CD23+慢性B细胞白血病及单克隆B淋巴细胞NK细胞CD3-CD(16+56)+自身免疫性疾病时降低,而病毒感染时升高CD3+CD57+CMV(巨细胞病毒)感染的强烈征兆

实验分组

同型对照管或空白对照(调节电压)

单标补偿管(电压不变,调节荧光补偿)

双标样本检测管1.取4只FCM测量管，编号blank、CD3、CD4、CD3\CD4，各管内加入100μl新鲜抗凝血；2.直接标记法：各管内加入相应的荧光标记抗人的单克隆抗体2ul，充分混匀，闭光孵育20～30min；3.溶血。ACK溶血剂:加入500μl

ACK溶血剂，充分混匀，反应10min,1500r/min离心5min，去上清，PBS洗1次；若红细胞存留较多，再重复溶血一遍。收集细胞上机检测。实验步骤ABC溶血剂配方A:0.12%甲酸(超纯水配置)B:碳酸钠6.0g/L;氯化钠14.5g/L;

硫酸钠31.3g/L(超纯水配置)C:多聚甲醛10.0g/L(PBS配置)ACK溶血剂配方150mM(8.025g)

NH4Cl

10mM

(1.01g)

KHCO30.1mM

(0.0372g)

Na2EDTA调PH至7.2-7.4，定容至1000ml无菌滤膜滤过，4℃保存荧光补偿“A门”内CD3/CD4的表达“A门”位置变化引起的改变“A门”位置变化引起的改变小鼠脾细胞CD3+/CD4+的表达流式检测胞内细胞因子步骤

1、肝素钠抗凝血1ml+1ml不完全1640培养液混匀，铺24孔板1孔。2、PMA（终浓度100ng/ml）+Ionomycin（终浓度1μg/ml），37℃5%CO2刺激2h。3、2h后加入阻断剂Monensin（终浓度2.5μmol/ml）混匀，继续培养4h。4、培养结束后，1500rpm*5min离心去上清。5、表面分子染色。取7只流式检测试管，每管中加入100μl压积血，按下列表格内容加入抗体染色，4℃避光染色30min。管号检测内容荧光抗体1空白对照无2荧光补偿管FITC-CD35μl3荧光补偿管PE-CD85μl4荧光补偿管Pecy5-CD85μl5荧光补偿管APC-CD35μl6同型对照APC-CD3;Pecy5-CD87测试管APC-CD3;Pecy5-CD86、溶血。各管内加入1mlBD溶血剂，混匀，室温避光静置10min，1500rpm*5min离心去上清。SB染色缓冲液1ml/管洗一次，1500rpm*5min离心去上清，混匀沉淀细胞。7、固定。各管内加入500μl2%PFA固定剂，4℃避光固定30min。1500rpm*5min离心去上清。SB染色缓冲液1ml/管洗两次，1500rpm*5min离心去上清，混匀沉淀细胞。8、透膜。各管内加入500μl透膜液，4℃避光10～15min。1800rpm*5min离心去上清。9、封闭。6、7号管加入25μl封闭液。（5μl小鼠血清+20μl10%BSA)4℃避光30min。10、胞内染色。6号管内加入同型对照抗体FITC-mIgG1和PE-mIgG1各2μl；7号管内加入抗体FITC-IFNg和PE-IL17各5ul。4℃避光染色30min后透膜液500μl/管洗一次,SB染色缓冲液1ml/管再洗一次。11、上机检测。2%PFA固定剂300μl/管混匀重悬4℃放置待检。流式检测外周血Treg细胞步骤1、采集静脉血2ml于肝素钠抗凝管内。2、表面分子染色。取7只流式检测试管，每管中加入100μl抗凝血，按下列表格内容加入抗体染色，4℃避光染色30min。

管号检测内容荧光抗体1空白对照无2荧光补偿管FITC-CD45μl3荧光补偿管PE-CD45μl4荧光补偿管Pecy5-CD35μl5荧光补偿管APC-CD35μl6同型对照Pecy5-CD3;FITC-CD4;PE-mIgG17胞内同型对照Pecy5-CD3;FITC-CD4;PE-CD258测试管Pecy5-CD3;FITC-CD4;PE-CD253、溶血。各管内加入1mlBD溶血剂，混匀，室温避光静置10min，1500rpm*5min离心去上清。SB染色缓冲液1ml/管洗一次，1500rpm*5min离心去上清，混匀沉淀细胞。4、固定。各管