谷氨酰胺发酵调控

谷氨酰胺的发酵控制

WEIBO.COM/JDPPT发酵条件控制代谢途径调控412右图是谷氨酰胺发酵工艺图L-谷氨酰胺是在谷氨酸发酵工艺基础上，在谷氨酰胺合成酶作用下生产L-谷氨酰胺。谷氨酰胺采用谷氨酸生产菌,可以实现谷氨酸发酵转向谷氨酰胺发酵。发酵转换的条件是:一、发酵培养基中有高浓度的铵盐存在,其含氮量比谷氮酸发酵时所用的氮量多得多,在谷氨酰胺合成酶的催化下,由谷氨酸进一步合成为谷氨酸胺；二、菌体增殖进入平衡期后,发酵pH值必须调整到6.0左右,以抑制谷氨酰胺酶的活力,避免谷氨酰胺被分解成谷氨酸。谷氨酰胺合成机理发酵条件的变更，谷氨酸产生菌中的谷氨酰胺合成酶活力增加，而谷氨酸合酶活力受到抑制Textinhere谷氨酸谷氨酰胺积累谷氨酰胺由于细胞环境的影响，谷氨酰胺易从细胞中分泌出来积累在发酵液中，而谷氨酸渗透性减小(滞留在细胞内)1发酵条件控制L-谷氨酰胺生物合成是在谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase，GS)催化下进行的，所以发酵法生产L-Gln的关键在于调控GS酶活性。NH4+浓度谷氨酸脱氢酶谷氨酰胺合成酶谷氨酸合酶GOGATTesch在谷氨酸棒杆菌(CorynebaCteriumglutamicum)中研究了NH4+浓度对GDH、GS、GOGAT活性的影响，结果如下：NH4+浓度增加时，GDH活性基本没有发生变化；NH4+浓度大于10mmol／L时，GS、GoGAT活性小于1mmol／L的10％，即分别低于110U／mg蛋白、42U／mg蛋白；发现谷氨酸脱氢酶酶促反应是谷氨酸棒杆菌摄取NH4+的第一步反应。此研究结果为梯度补氮生产L-Gln提供了理论基础。GS的表达易受到高浓度铵盐的阻遏，氮源的一次性补加也容易导致谷氨酰胺合成酶活性急剧下降；在铵盐不足时，GS表达量就会增加，所以氮饥饿处理可以提高中GS的表达量，梯度补加氮源也可以尽量减少GS活力的快速丧失。1.1氮源氮饥饿处理李春等为了解决高浓度铵盐阻遏谷氨酰胺合成酶表达与谷氨酰胺合成需要过量铵之间的矛盾，提出了原位氮饥饿与铵盐梯度补加协同调控策略，提高了谷氨酰胺的产量，最高可达2.19%，比原位氮饥饿工艺提高了近72%，比未经过氮饥饿处理的旧工艺提高了近200%。陈奎发等设计了在线氮饥饿处理的发酵过程；在限制初始氮源浓度的条件下，菌体在生长后期自然进入氮饥饿状态，GS酶表达量增加，此后再提供充足的铵盐，提高L-Gln的合成能力，结果使L-Gln的产量提高了69％，达到11.5g／L，菌体内谷氨酰胺合成酶活性提高了2倍以上。1.2金属离子为了提高谷氨酰胺的产量，金属离子特别是Zn2+、Mg2+和Mn2+的供给是必要的。Zn2+对谷氨酰胺合成酶具有刺激作用，同时Zn2+还可增强NH4Cl对谷氨酰胺酶的抑制作用，使其不能分解谷氨酰胺。1.3pH对谷氨酰胺发酵的影响pH主要影响酶的活性和菌的代谢

在中性和微碱性条件下（PH7.0-8.0）积累谷氨酸，在酸性条件下积累谷氨酰胺发酵前期应控制pH值在偏碱性环境，以促进菌体生长，并激活谷氨酸合成酶的活性，保证谷氨酰胺合成前体谷氨酸的合成；发酵后期应控制pH值在偏酸性环境，以增加谷氨酰胺合成酶的活性，同时抑制谷氨酰胺酶的活性，使谷氨酰胺大量积累生成，而减少谷氨酸的生成量。1.4供氧对谷氨酰胺发酵的影响氨基酸发酵过程中，供氧不足会积累乳酸等副产物，菌体减少。通过通气搅拌增加溶氧量。生产谷氨酰胺条件影响细胞膜通透性二代谢途径调控天津短杆菌株合成谷氨酰胺的主流代谢中，有几个关键酶控制其强度，这几个酶分别受不同代谢物的反馈调节，活化这些酶有利于L-GLn的生物合成。（1）磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，它受天冬氨酸的反馈抑制；（2）丙酮酸激酶，它是一个别构酶，受乙酰CoA、丙氨酸、ATP的反馈抑制；（3）丙酮酸脱氢酶系，该酶是催化不可逆反应的酶，受乙酰CoA、NADH、GTP的反馈抑制；（4）异柠檬酸脱氢酶，ADP和NADH抑制此酶的活性；（5）Glu脱氢酶和（6）GLn合成酶，此二酶是保证α-酮戊二酸向GLu而不是向草酰乙酸的三羧酸循环方向的关键。同时在此循环中还存在着向天冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸的分枝代谢，我们设法减弱分枝代谢而强化主流代谢，主要的方法是减弱催化这些分枝代谢的酶。

生物合成途径中关键酶的调控陈国强等人重组了一株含有透颤菌血红蛋白基因vgb和谷氨酰胺合成酶突变基因glnA’的野生谷氨酸棒杆菌C.glutamicumATCC14067，可以实现在较低溶氧量水平，较低成本下，生产较高产量的谷氨酰胺。vgb是编码细菌中血红素蛋白(VHb)的基因，VHb是以氧合态参与和氧有关的代谢，通过将氧传递给呼吸链，而调节末端氧化酶的活性，改变氧化磷酸化的效率，进而改变低氧条件下的代谢途径，从分子水平上提高重组菌对氧气的利用能力，为解决谷氨酰胺大规模生产过程中要求高溶氧的问题提供了一个想法。谷氨酰胺合成酶突变基因谷氨酰胺合成酶／谷氨酸合酶(GS／GOGAT)体系是由铵离子浓度调节的，在较低铵离子浓度下发挥作用，在高铵离子浓度条件下受抑制。谷氨酰胺合成酶的调节开关是在其肽链405位置的酪氨酸被定点突变为苯丙氨酸，从而失去了这种调节机制，使得谷氨酰胺合成酶可以在高铵离子条件下发挥催化功能，将谷氨酸转化为谷氨酰胺。中村纯等人通过敲除细菌染色体上的谷氨酸合酶基因的方法降低细胞内谷氨酸合酶活性,来减少谷氨酰胺的分解;通过增加编码谷氨酰胺合成酶基因的拷贝数和修饰编码谷氨酰胺合成酶基因的翻译控制区,来增强谷氨酰胺合成酶基因的表达,促使菌体内积累更多的谷氨酰胺。郑强等进行glnA基因的克隆与过量表达，利用谷氨酸棒杆菌发酵过程产生的谷氨酸为底物，在glnA基因表达的GS酶的催化下，诱导后的重组茵发酵液中的L-谷氨酰胺产量提高了1.8倍，培养基质中的铵盐反应生成L-谷氨酰胺，理论上可以节