荧光显微技术

荧光显微镜荧光显微镜

利用一定波长的激发光对样品进行激发，产生一定波长的荧光，对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。

四、荧光显微镜的基本结构光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯

滤光片：隔热、激发和吸收滤光片光路：透射光、落射光聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光器镜头：消色差镜头

荧光显微镜荧光显微镜的基本结构隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。激发滤光片：位于光源和物镜之间，能选择性地透过紫外线可见波长的光域，提供合适的激发光。

吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光透过，保护眼睛。荧光显微镜滤光片荧光显微镜的基本结构透射光：照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经标本反射进入物镜。透射荧光显微镜光路(a)落射荧光显微镜光路(b)荧光显微镜光路荧光显微镜的基本结构一.荧光显微镜的原理某些物质在一定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时,就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如见光)，这种光就称为荧光。

荧光显微镜利用特殊的照明装置发出较短波长的激发光，诱发荧光物质发出荧光,通过物镜作用在样品上，在有目镜观察到肉眼可见的荧光。二.荧光显微镜的结构主要结构有机械系统和光学系统两部分，如图

1.机械系统：包括底座、镜身、观察筒三部分

2.光学系统:包括物镜、聚光镜、光源等三.荧光显微镜的操作及注意事项1．基本操作步骤

(1)安装紫外防护罩。

(2)打开高压汞灯的电源控制箱开关。

(3)插入挡光板，中断光路。

(4)预热5—10分钟。

(5)将载有样品的载玻片放到载物台上。

(6)选择接物镜(按照先低倍，后高倍顺序)。

(7)旋转分光镜组件转盘，选择所需要的分光镜组件：“O”为观察透射光时用；“WU”为观察蓝色荧光时用(如DAPl)；“WB”为观察绿色荧光时用(如FITC)；“WG"为观察红色荧光时用(如TRITC)。

(8)使用阻断滤片(目前多数阻断滤片内置于荧光显微镜)。

(9)通过粗、细螺旋调整焦距。

(10)打开与显微镜连接的计算机，点击数码成像系统软件，采集数码图像。2.注意事项

(1)因观察荧光使用的光源为高压汞灯，其中发出的光含紫外光，对人眼有损害作用，故必须安装紫外防护罩。

(2)为延长汞灯寿命，打开汞灯后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要等15分钟后才能关闭。

(3)汞灯熄灭后待完全冷却才能重新启动，否则灯内汞蒸气尚未恢复到液态，内阻极小，再次施加电压，会引起短路，导致汞灯爆炸。这样不仅损坏电器，更重要的是汞蒸气溢出，将导致工作室污染。故关闭汞灯之后，不能马上再次打开，必须等待至少30分钟。

(4)高压汞灯工作时会散发大量的热量，因此，工作环境温度不宜太高，必须有良好的散热条件。

(5)汞灯的使用寿命约200—300小时，在电源控制箱上有时间累计计数器，使用者要记录累计小时数，达到300小时，需更换新灯泡，否则亮度不够，影响观察四.荧光显微镜标本制作要求（一）载玻片载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。（二）盖玻片盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了加强激发光，也可用干涉盖玻片，这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质（如氟化镁）的盖玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发光，这种反射的激发光女可激发标本。（三）标本组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。（四）封裱剂封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/lpH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。（五）镜油一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光镜油，也可用上述甘油代替，液体石蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。五.荧光显微镜应用技术1.

对细胞结构或组分的定性位、半定量研究免疫荧光技术

用荧光标记的抗体或抗原与样品(细胞、组织或分离的物质等)中相应的抗原或抗体结合，以适当检测荧光的技术对其进行分析的方法。将抗原或抗体与荧光染料连接，用于检测相应特异性的抗体或抗原的方法称“直接免疫荧光技术(directimmunofluorescenttechnique)”。用荧光染料标记的第二、第三抗体等检测相应抗原抗体复合体的方法则称“间接免疫荧光技术(indirectimmunofluorescenttechnique)”。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位2.作为生物大分子筛选与鉴定的标记物。绿色荧光蛋白绿色萤光蛋白(greenfluorescentprotein)，简称GFP，其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光在生物学研究中绿色荧光蛋白具有广泛用途，包括有

1.分子标记

利用绿色荧光的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签(proteintagging)，即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察2.药物筛选

荧光探针分布是利用信号传导中信号分子的迁移功能，将一荧光蛋白与信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子的迁移状况，并推断该分子在迁移中的功能。由于GFP分子量小，在活细胞内可溶且对细胞毒性较小，因而常用作荧光探针直接法直接荧光抗体染色法示意图荧光素标记的特异性抗体直接与相应抗原反应。六、荧光抗体染色间接法特异性抗体与相应抗原反应，荧光素标记的抗抗体再与第一抗体结合。

间接荧光抗体染色法示意图荧光抗体染色双标记法两种荧光素分别标记的两种不同的特异性抗体，与同一标本反应，荧光显微镜观察两种颜色荧光。荧光抗体染色

设立实验对照:阳性对照和阴性对照

区分特异和非特异染色

阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型荧光抗体染色结果判断荧光抗体染色①自身抗体检测抗核抗体(均质型)抗核抗体(核膜型)抗核抗体(斑点型)荧光抗体技术的应用②病原体检测寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）细菌（藤黄微球菌)荧光抗体技术的应用③免疫病理检测肿瘤（人肝癌细胞）荧光抗体技术的应用七、荧光原位杂交概念：原位杂交技术(Insituhybridization，ISH)是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织，细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。原理：利用核酸分子单