细菌内毒素定量分析

细菌内毒素光度测定法试验讲义讲解董光宴

1、光度测定法概述

2、试剂和仪器3、标准曲线

4、干扰试验5、检查法

湛江博康海洋生物有限公司2/1/20231博康一、光度测定法概述1、定量法的概念2、定量法的分类3、定量法的原理2/1/20232博康1定量法的概念

光度测定法分为浊度法和显色基质法：浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，可分为终点浊度法和动态浊度法。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。

2/1/20233博康2定量法分类2/1/20234博康3定量法的原理（1）动力学曲线：细菌内毒素与鲎试剂反应过程中，随着反应的进行，混合物会逐渐变混浊，内毒素浓度越高浊度变化越快，浊度变化符合反应动力学曲线。2/1/20235博康（2）细菌内毒素含量与时间的关系：细菌内毒素浓度与反应时间分别取对数后，将两组数据用最小二乘法统计，可以得到直线：LgT=a+bLgC

我们将这条直线称为标准曲线。2/1/20236博康（3）、数学原理原理：OD=-Lg（It/Io）

0.02=-Lg（It/Io）

It=95%Io2/1/20237博康二试剂和仪器光度测定法鲎试剂（生产单位：湛江博康海洋生物有限公司，批号：0907104，检测限：0.015EU/ml；规格为1.25ml/支）细菌内毒素检查用水（生产单位：湛江博康海洋生物有限公司，批号：0908030，规格：2ml/支）2/1/20238博康细菌内毒素工作标准品（200966，120EU/支，中国药品生物制品检定所提供）氯化钾注射液（规格：1g/10ml批号：0911211，生产厂家：河北某制药厂）细菌内毒素定量检测仪（生产单位：天大天发科技有限，型号：BET-72）2/1/20239博康三标准曲线1、制作标准曲线的条件2、标准曲线的选择3、标准曲线的制作4、标准曲线有效的条件5、结果分析2/1/202310博康1制作标准曲线的条件当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能会影响检验结果的改变时，需进行标准曲线的可靠性试验。用标准内毒素配成溶液，并制成至少3个浓度的稀释液（相邻浓度间稀释倍数不得大于10），最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。2/1/202311博康2标准曲线的选择

制做标准曲线的内毒素浓度可选择10倍、5倍、4倍和2倍稀释的等比系列点，也可选择非等比系列点。一般情况下，我们不推荐10倍和2倍等比系列点，10倍等比系列点（如10EU/ml、1EU/ml、0.1EU/ml和0.01EU/ml）跨度大，其相关系数R和准确性都受到一定限制；2/1/202312博康2倍等比系列点（如0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml和0.06EU/ml）跨度太小，其相关系数R和准确性都较好，但很不实用。我们推荐选用4倍等比系列点（如2EU/ml、0.5EU/ml、0.125EU/ml和0.03EU/ml）跨度适中，其相关系数R和准确性都较好，而且非常实用。2/1/202313博康3标准曲线的制作3.1内毒素标准品的溶解稀释首先将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水1ml溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制备成2EU/ml、1EU/ml、0.5EU/ml、0.125EU/ml和0.03EU/ml备用。2/1/202314博康200EU/ml20EU/ml2.0EU/ml1.0EU/ml0.5EU/ml0.03EU/ml0.125EU/ml0.3ml0.3ml2.7ml2.7ml1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml0.5ml0.5ml图示2/1/202315博康3.2定量法鲎试剂的溶解分装

将复溶好的光度测定法鲎试剂分装到14支定量分析专用试管中，每管分装0.1ml。定量法鲎试剂定量试管每管0.1ml2/1/202316博康3.3加样

将内毒素加入定量分析专用试管中，每个浓度做3支平行管，剩下两管加入BET水作为阴性对照，每管加样量均为0.2ml。2EU/ml0.5EU/ml0.125EU/ml0.03EU/mlBET水2/1/202317博康注：产品名称：有机玻璃试管架用

途：细菌内毒素检查定量法中用于摆放小试管。特

点：有机玻璃材料可保护定量法小试管，避免定量法小试管被磨花而影响试验结果。2/1/202318博康3.4检测

加样完毕后用封口膜密封试管，将每支试管在旋涡混合器上点1-3秒，然后将试管对应插入已恒温的定量检测仪（37℃），仪器开始自动采集数据。注：封口膜的优点规

格：4IN×35FT（4英寸×35英尺）特

点：进口代销，比较适合用于定量法专用试管的封口，清洗时不留任何残留物。

2/1/202319博康4标准曲线有效的条件当阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间，将全部数据进行线性回归分析。根据线性回归分析，标准曲线的相关系数（r）的绝对值应该大于或等于0.980，试验方为有效。平行管的变异系数＜10%。2/1/202320博康5结果分析

内毒素反应时间变异系数实测内毒素0>720000>72002.07900.36%2.01182.07940.511591.01%0.50220.511400.12516200.34%0.12170.12516340.0323980.04%0.03180.032381

标准曲线：LogT=2.9783-0.2621LogC，相关系数：=-0.9999,标准曲线符合规定。2/1/202321博康四干扰试验1、限值的确定2、干扰试验浓度的计算3、检测浓度的选择4、干扰试验溶液的制备5、供试品溶液的稀释6、干扰试验的制备方法7、干扰试验加样8、判断的标准9、试验结果分析10、结论2/1/202322博康1限值的确定

2010版《中国药典》二部正文1014页【氯化钾注射液】。L=0.12EU/mg2/1/202323博康2干扰试验浓度的计算

按照中国药典2010年版提供的公式计算最大有效稀释倍数（注：其中标准曲线的最低点λ为0.015EU/ml）。最大有效稀释倍数：

MVD=CL/λ=100Х0.12/0.015=800倍2/1/202324博康3检测浓度的选择

样品限值表达方式为EU/ml，直接选用其无干扰浓度并填写相应稀释倍数即可；样品限值表达方式为EU/mg，无论其干扰情况如何，我们推荐以1mg/ml为初始浓度，选用其以下的无干扰浓度并填写从1mg/ml开始的相应稀释倍数，这样检测结果即为样品每ml或mg中内毒素的量。我们将检测结果直接与限值比较即可。2/1/202325博康4干扰试验溶液的制备编号内毒素浓度被加入内毒素的溶液平行管数A无1.0mg/ml或0.5mg/ml至少2B标准曲线的中点（或附近点）的0.5EU/ml（设为λm）1.0mg/ml或0.5mg/ml至少2C2.0EU/ml、0.5EU/ml、0.125EU/ml、0.03EU/ml四个浓度检查用水每一浓度至少2D无检查用水至少22/1/202326博康5供试品溶液的稀释

用细菌内毒素检查用水将氯化钾注射液稀释到2.0mg/ml、1.0mg/ml和0.5mg/ml备用。操作过程必须严格遵守无菌操作规程，保证无外源物质的干扰。

2/1/202327博康

10.0mg/ml

2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.3ml2.7ml1.0ml1.0ml0.3ml4.0ml1.0ml0.3ml100mg/ml图示2/1/202328博康6干扰试验的制备方法

取氯化钾注射液的2.0mg/ml、1.0mg/ml稀释液分别加入四支试管中，每管加0.3ml，然后分别吸取0.3ml的内毒素标准溶液，浓度为1.0EU/ml按下图加入其中两支试管中，另外吸取0.3ml的检查用水加入其中另外两支试管中。将这四支管混合均匀即可得到氯化钾注射液的1.0mg/ml、0.5mg/ml稀释液干扰试验所需样品溶液。2/1/202329博康氯化钾注射液内毒素标准溶液1.0EU/ml0.3ml0.3ml0.3ml(2.0mg/ml)0.3ml(2.0mg/ml)0.3ml(1.0mg/ml)0.3ml(1.0mg/ml)BET水0.3ml0.3ml图示2/1/202330博康7干扰试验加样

取分装了0.1ml定量法鲎试剂的定量专用试管10支，每个浓度做2支平行管，氯化钾注射液的1.0mg/ml、0.5mg/ml稀释液干扰试验各4支；另做2支阴性对照，每管加样量均为0.2ml。加样完毕后密封试管，将每支试管在旋涡混合器上点1-3秒，然后对应插入定量检测仪，仪器开始采集数据。

2/1/202331博康0.1ml鲎试剂0.1ml鲎试剂0.1ml鲎试剂1mg/ml的加样0.2ml0.2ml0.5mg/ml的加样0.2ml阴性对照图示2/1/202332博康8判断的标准

按所得线性回归方程分别计算供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量Ct和Cs，再按下式计算该试验条件下的回收率（R）。R=(CS-Ct)/λm×100%当内毒素的回收率在50%-200%之间，则认为在此该试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。2/1/202333博康图示回收率：

R=(CS-Ct)/λm×100%=×100%2/1/202334博康9试验结果分析样品氯化钾注射液干扰试验结果2/1/202335博康回收率R：以样品浓度C=1.0mg/ml（即稀释倍数为1)以9、10、11和12管为例，计算该浓度下的回收率（R）。R=(CS-Ct)/λm×100%=（0.4654-0.0122）/0.5×100%=90%注：如果检测结果小于检测限，计算回收率时以0计。

2/1/202336博康10结论结论：依据<中国药典>2010版附录“细菌内毒素检查法”，氯化钾注射液细菌内毒素检查干扰试验1.0mg/ml和0.5mg/ml的稀释液符合试验要求，对鲎试验没有干扰。常规检查选用其中任一浓度即可。

2/1/202337博康五检查法1检测浓度的选择如样品有干扰作用，选择符合干扰试验要求的第二个浓度作为日常检查的浓度。2/1/202338博康2试验有效条件试验必须符合以下三个条件方为有效：标准曲线要符合“可靠性试验”中的要求；计算出的内毒素的回收率要在50%-200%的范围内；阴性对照的反应时间应大于标准曲线最低浓度的反应时间。

2/1/202339博康

3结果判断

若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后，小于规定的内毒素限值，判供试品符合规定。若大于或等于规定的内毒素限值，判供试品不符合规定。

2/1/202340博康六、光度测的特点1、定量仪器取值方法2、定量法的特点3、动态浊度法和凝胶法的比较2/1/202341博康1定量仪器取值方法2/1/202342博康1.1透光率反应时间取值法T0.95

在鲎试验中，细菌内毒素浓度与反应达到某一状态的时刻有关，只要测出这一时间就可算出内毒素的实际浓度，这一过程叫反应时间取值方法。透光率反应时间取值法使用透光率描述鲎试剂的浊度变化。日本的ET-201型仪器采用该方法，即t0.95法。但该法所描述的透光率反应曲线与反应产物的量呈非线性关系。2/1/202343博康1.2光密度反应时间取值法T0.02

光密度限值法预设一个光密度OD值，当反应曲线从开始上升到预设值时经理的时间作为反应时间，此方法的优点是时刻变化的OD值与反应产物的数量成正比，也就是吸光度变化曲线与凝胶产物的产生关系呈线性，取OD值上升0.02作为预设点，该点在反应曲线上的位置为浊度开始快速变化的时期，该取值能够快速、稳定的获得反应时间。2/1/202344博康1.3浊度反应时间取值法T50

浊度-时间曲线法每一管的浊度总是从0-1，这就是所谓“归一法”，这种动态浊度法必须求出浊度达到0.5的时间t50，t50与拐点极为接近，用该点代替拐点。T50法很有优势，但要求每次鲎试验必须达到反应终点，否则无法获得终末透光强度，无法测得完整的浊度曲线，