细菌内毒素检测试验注意事项与误差分析

细菌内毒素检测试验注意事项与误差分析董光宴工程师一、实验注意事项二、影响试验结果的因素分析湛江博康海洋生物有限公司2/1/20231博康一、试验操作注意事项

——2010年版《中国药品检验标准操作规程》P310细菌内毒素检查法

实验前，须用肥皂洗手，用75％酒精棉球消毒。在使用洗耳球、移液管取样时，应注意不要将洗耳球中的气体吹入溶液中，以防止气体中的内毒素进入供试液。复溶0.5ml鲎试剂时，在旋涡混合器上点击1～3秒，促进鲎试剂的溶解。2/1/20232博康由于凝集反应是不可逆的，所以在反应过程中及观察结果时应注意不要使试管受到振动，以免使凝胶破碎产生假阴性结果。进行干扰实验时，标准对照系列和含内毒素的供试品溶液系列应同时进行，并使用同一支细菌内毒素标准品。2/1/20233博康在进行鲎试剂灵敏度复核、干扰实验和供试品细菌内毒素检查时，各个实验中要求的对照应同时进行，并在实验有效的情况才能进行计算和判断。在进行鲎试剂灵敏度复核、干扰实验和供试品细菌内毒素检查时，各个实验中要求的对照应同时进行，并在实验有效的情况才能进行计算和判断。2/1/20234博康二、影响试验结果的因素分析鲎试剂细菌内毒素工作标准品细菌内毒素检查用水环境实验器皿实验人员样品试验2/1/20235博康1鲎试剂质量标准：WS1-363（B-123）-91

性状、鉴别、检查、灵敏度测定、用途、规格、贮藏应用标准：干扰能力、稳定性国外标准：无菌2/1/20236博康1鲎试剂灵敏度：在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。——2010版《中国药典》国外鲎试剂：灵敏度由FDA统一标定2/1/20237博康1鲎试剂鲎试剂灵敏度复核的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度是否准确，也是考查检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。因此要求每个实验室在使用一批新的鲎试剂进行供试品干扰实验或供试品细菌内毒素检查前必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。——2010版《中国药品检验标准操作规程》2/1/20238博康1鲎试剂外观：本品为白色或类白色冻干块或粉末，在水和生理盐水中易溶。干扰能力：指在药品、生物制品和血液制品中鲎试剂能准确测出被测物质内毒素的能力，既不能造成样品内毒素的漏检，也不能将其它物质错判为内毒素。鲎试剂参考品：150603-201003，2.2ml/0.06EU

2/1/20239博康2细菌内毒素标准品引起的误差细菌内毒素标准品种类细菌内毒素标准品效价误差细菌内毒素标准品操作误差细菌内毒素标准品的错误使用

2/1/202310博康1）细菌内毒素标准品种类细菌内毒素国际标准品（IS2，94/580）细菌内毒素国家标准品（200707）细菌内毒素工作标准品（200758-201174）国外内毒素标准品：国标、工作品

2/1/202311博康2）细菌内毒素标准品用途细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。

细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。——2010年版《中国药典》2/1/202312博康3）细菌内毒素标准品效价误差细菌内毒素国家标准品与细菌内毒素工作标准品之间或细菌内毒素工作标准品与细菌内毒素工作标准品之间的生物效价存在一定的误差，用不同细菌内毒素标准品复核同一批鲎试剂灵敏度时可能存在一定的误差。中国药典要求“当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。”试验结果只要在这合格范围内表示鲎试剂标示灵敏度准确。2/1/202313博康4）内毒素标准品操作误差

取细菌内毒素工作标准一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，用75%酒精棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。——2010年版《中国药品检验标准操作规程》正确（易折点）错误2/1/202314博康注意：①只能在安瓿的易折点上部开启内毒素，不能沿易折点开启，防止振荡过程中内毒素粘在封口膜上。②只能取1ml的细菌内毒素检查用水复溶细菌内毒素工作标准品。③若使用的为细菌内毒素国家标准品，可按其使用说明书中的方法将其稀释至规定浓度后分装保存。若为细菌内毒素工作标准品，为一次性使用。2/1/202315博康5）错误使用使用内毒素工作标准品标定鲎试剂灵敏度使用厂家的内毒素复核鲎试剂灵敏度厂家内毒素交叉复核鲎试剂灵敏度使用厂家的内毒素做干扰实验厂家的内毒素做于定量实验2/1/202316博康3细菌内毒素检查用水细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。灭菌注射用水内毒素含量PH值无干扰作用2/1/202317博康4环境为保证实验结果的准确性，防止污染，内毒素检查实验应在密闭的洁净室中或密闭实验室的超净工作台下进行。——2010年版药品GMP实施指南密闭的洁净室中密闭实验室的超净工作台实验室温度：≤26℃实验室湿度：45%～75%2/1/202318博康1）温度将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水稀释成2λ，进行鲎试验，然后分别放置于25、28、31、34、37、41、43、46、49℃水浴保温。实验中观察到凝胶形成的速度随着温度的升高而加快，但到达49℃保温90min也未出现凝胶。从实验可以看出，温度对鲎试剂的灵敏度影响很大，保温温度在25～41℃之间，随着温度的升高，反应速度也升高，41℃尚未达到反应速度峰值，25℃时反应速度已相当快；在41～46℃之间，温度对鲎试剂的灵敏度无明显影响；达到49℃或更高温度时，随温度升高而使酶蛋白逐渐变性，则鲎试剂被破坏，反应速度反而降低。2/1/202319博康2）湿度吸潮灵敏度增高挥发2/1/202320博康5实验器皿器皿的计量管理（校正）器皿的选择标准器皿的正确处理2/1/202321博康1）器皿的选择标准鲎试验对器皿的要求：刻度准确；内表面光滑；易于清理。细菌内毒素检查实验不宜选用注射器，最好使用经过校正的玻璃刻度移液管或精密移液器。注射器刻度不精确，内壁磨沙面吸附内毒素，而且要特别注意注射器针头引入的铁离子对试验结果的干扰，故不宜选用注射器。2/1/202322博康

如果用量不大，使用频率不高，建议大家选用本公司提供的一次性耗材。无热原耗材是一种在此行业中被鉴定为无内毒素和β-葡聚糖污染的产品，其中包括,无热原试管、无热原移液器吸头。这些产品可以给您的工作带来很大方便,另外，当实验出现误差时可首先排除器皿方面的因素,很快分析判断出误差原因。2/1/202323博康2）器皿的正确处理2010年版《中国药品检验标准操作规范》310页——细菌内毒素检查法“3实验准备”规定：3.1.1玻璃器皿的洗涤将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内，放置入烤箱。2/1/202324博康

3.1.2除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素玻璃器皿置烤箱后，将烤箱调至250℃，待烤箱温度升至设定的温度后开始计时，干烤30分钟以上。达到规定时间后，关断电源，待烤箱温度自然降至室温。在不打开金属容器的情况下，可在两天内使用；如果玻璃器皿用锡箔纸包装，在不打开包装的情况下可在两周内使用，否则须再次干烤除去可能存在的外源性内毒素。2/1/202325博康蒸馏水有效期应该特别注意，该规程明确规定最后冲洗玻璃器皿必须“用蒸馏水冲洗，禁用纯化水冲洗。”有的客户使用反渗透制备的纯化水冲洗试验用玻璃器皿，结果试验中所有的阳性对照都为阴性，复核鲎试剂灵敏度时试验结果误差较大，这主要是由于纯化水和蒸馏水的质量不同所造成的。2/1/202326博康6

实验人员

负责质量检验的人员应受过适当教育，并经专业技术培训，具有基础理论知识和实际操作技能。质量控制实验室所有人员的职责应当书面规定。内毒素检测人员应经过严格的培训，并应配备相应的防护设施（如穿防护服、戴口罩、头套等）。——2010年版药品GMP实施指南2/1/202327博康7

样品β-葡聚糖样物质的影响PH值的影响金属离子和弱酸阴离子的影响药物浓度的影响

2/1/202328博康1）β-葡聚糖样物质的影响常见现象：假阳性。鲎试剂的特异性系指在药品、生物制品和血液制品中鲎试剂能准确测出被测物质内毒素的能力，既不能造成样品内毒素的漏检，也不能将其它物质错判为内毒素。2/1/202329博康目前我公司研究证明，已知能与鲎试剂发生反应的物质有细菌内毒素和β-葡聚糖，而内毒素反应曲线为S型特征曲线，β-葡聚糖反应曲线为经过0点的斜线。鲎试剂的特异性差的另一种表现，是将其它物质（如β-葡聚糖）判定为内毒素，错误将合格药品判为不合格，造成制药厂直接经济损失。2/1/202330博康鲎试剂反应机理图2/1/202331博康判断假阳性的方法：1、特异性鲎试剂法；2、定量反应曲线分析法；3、家兔模拟试验法。2/1/202332博康2）PH值对反应速度的影响常见现象：样品阳性不成立。鲎试剂与内毒素反应的最适宜pH在6.5-8.0；pH≤3或≥10时，酶活性受到抑制。相对活力PH7.02/1/202333博康PH对反应速度的影响:影响酶原的激活；影响酶分子的构象，过高过低的PH会改变酶的活性中心的构象，或甚至改变整个酶分子的机构使其变性失活。2/1/202334博康故鲎试验时，供试品pH最好应预调和6.5-8.0为好，必要时可用无内毒素的HCl

或NaOH

稀溶液调节pH值。美国、日本药局方以及中国药典故2005版规定检品必须调节PH值6.0-8.0。2/1/202335博康3）金属离子和弱酸阴离子

离子对细菌内毒素测定结果影响较大，一方面阳离子如Fe3+、Al3+强度较大会引起内毒素的聚集造成内毒素局部浓度过高，同时还必须注意高价阳离子（如Fe3+）的氧化性对鲎试剂酶反应具有强抑制作用；重金属离子如Ag+、Cu2+、Pb2+可以使蛋白质变性而使酶失活；另一方面鲎试剂必须在二价阳离子Ca2+、Mg2+的参与下才能被激活形成凝胶反应。许多药物因PH值≥10时，其中的阴离子会吸收鲎试剂中的Ca2+、Mg2+离子，使实验呈假阴性。2/1/202336博康4）药物浓度1、10%葡萄糖注射液2、白蛋白、小牛血清3、医用透明质酸钠4、中药类注射液

2/1/202337博康7试验操作规程操作时间操作顺序操作细节2/1/202338博康

1）操作时间

将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水稀释成2λ，进行鲎试验，37℃保温，分别在10、20、30、40、50、70min时观察，发现凝胶的形成状态随着时间的延长而坚固。因此夏天室温较高，如果试验操作时间太长，细菌内毒素与鲎试剂混合液不等进入反应仪器反应已开始，实际反应时间超过1小时。由于室温不同，冬夏季节、南北地区之间的操作误差将会很大。即使在25℃准室温下操作，操作时间拖得过长，细菌内毒素含量较高时，测定误差也不会小。2/1/202339博康2）操作顺序操作时严格按操作规程进行，安瓿开启前应先用酒精棉球擦拭曲颈部，用将颈部折断，防止碎玻屑掉入安瓿内。在鲎试剂的溶解、样品