现代分子生物学技术基础之DNA克隆

现代分子生物学技术基础

二十一世纪医学发展的主要特点之一是对生命现象和疾病本质的认识深入到分子水平。健康的保持或疾病的发生都与生物分子相互作用密不可分，这一理念已成为共识。分子生物学已成为当今生命科学研究的主流,分子生物学技术是相关研究必不可少的工具。

多年来,已建立了许多分子生物学技术，新的技术还在不断出现,从不同水平探索生命的奥秘。核酸分析相关技术是其重要基础。本章将以此为起点与核心，介绍分子生物学的常用技术及新进展。第一节、DNA克隆第二节、DNA、RNA的分析及转录调控分析技术第三节、蛋白质的表达及蛋白质组学分析的主要技术第四节、表观遗传学分析技术简介第五节、转基因动物和基因打靶技术的分子生物学基础载体的概念、特征和类型；重组DNA技术、PCR技术的原理、步骤和应用；实时定量PCR的概念。Southern和Northern杂交的原理、步骤和应用；DHPLC检测DNA变异的基本原理；染色质免疫沉淀技术的基本原理及应用；报告基因的概念。蛋白质表达主要检测方法的类别；蛋白质组学的概念。RNA干扰、miRNA的概念、作用机制、研究策略及应用；亚硫酸氢盐处理DNA后，进行DNA甲基化检测的基本原理。转基因动物及基因打靶的概念，影响转基因表达的因素。本章重点内容提示第一节、DNA克隆克隆的概念克隆(clone)：是指用无性繁殖的方法产生与亲代完全相同的子代个体或群体。分子克隆（DNA克隆） 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）精细胞卵细胞有性繁殖（母源和父源基因组）

乳腺细胞卵细胞子宫内胚胎发育无性繁殖（核供体基因组）DNA克隆是特异DNA片段或基因的选择扩增细胞—DNA克隆：利用细胞内的DNA复制机制PCR—DNA克隆：细胞外或体外多聚酶链反应(PolymeraseChainReaction)一、细胞—DNA克隆

实现DNA克隆所采用的方法称为重组DNA技术（RecombinantDNATechnique）:

人类根据需要选择目的基因（DNA片段）在体外与基因运载体连接形成重组DNA分子,然后导入适当宿主细胞,使其扩增得到大量相同的DNA片段;或表达相应的基因产物。重组DNA技术，兴起于20世纪70年代。基因工程是重组DNA技术的产业化设计与应用。人类实现对基因进行自如地操作、转移和改造的理想，是在限制性核酸内切酶、载体、连接酶和其它修饰酶被陆续发现以后才得以实现.1限制性核酸内切酶

（restrictionendonuclease）

70年代早期，发现细菌中存在能切割双链DNA的酶，限制进入细菌内的外源DNA，称为限制性核酸内切酶（限制酶）。迄今已从不同细菌中分离了许多种限制酶，其发现和应用促进了重组DNA技术的发展。1）限制酶分类

几乎所有原核生物都含有限制酶，根据结构和功能特性分为：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Ⅰ型切点不固定Ⅲ型切割位点在识别位点之外Ⅱ型特异性切点位置可以控制和预测，产生固定的DNA片段，重组DNA技术中所用的限制酶均为Ⅱ型。

2）限制酶命名命名原则：根据限制酶来源的微生物学名命名。第1个字母大写（斜体）代表该酶宿主菌的属名第2、3个字母小写（斜体）代表该酶宿主菌的种名第4个字母大写（正体）代表该酶宿主菌的菌株。如果从一个菌株中发现了数种限制酶，根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。从EscherichiacoliRY13中第1个分离的限制性酶

EcoRⅠ3）限制酶识别序列限制酶切断DNA分子磷酸二酯键的核酸酶。

酶

来源

切割序列长度kb(人类DNA)HaeIIIHemophilusaegyptusGGCC0.6TaqIThermusaquaticusTCGA1.4HindIIIHemophilus

influenzaeRdAAGCTT3.1EcoRIEscherichiacoliRfactorGAATTC3.1PstIProvidenciastuartiiCTGCAG7.0SmaISerratiamarcescensCCCGGG78NotINorcadiaotitida-caviarumGCGGCCGC97664）限制酶主要特征（1）特异识别4~8个碱基对，通常为回文序列，即按5′→3′方向阅读，

DNA双链碱基顺序相同。（2）

切断DNA分子的磷酸二酯键（3）限制片断末端：平末端（bluntends）：切割点在识别序列的对称轴上突出末端（overhangingends）：交错切割DNA5′突出末端

3′突出末端突出末端易于通过碱基互补彼此连接，又称黏性末端产生相同突出末端的DNA片段，可有三种方式：①用相同的限制酶②用识别序列相同的不同限制酶即同裂酶(isoschizomers)；③用识别不同序列但产生相同粘性末端的限制酶；如BamHI和MboI。不同限制酶切割产生的限制性片段

2、

DNA连接酶1967年在三个实验室同时发现一种封闭DNA链上缺口的酶，借助ATP等水解提供的能量催化DNA链的5′-PO4-与另一DNA链的3′-OH生成磷酸二酯键，即DNA连接酶。经限制酶切割和DNA连接酶的作用，将靶DNA序列和载体DNA连接成重组DNA3.载体

1）载体的定义及其特征（1）载体(vector)定义：将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。

①分子量小，以容纳较大的外源DNA；②有多种限制酶单一识别序列，有助于外源

DNA片段插入；

③载体DNA被切割并插入外源DNA后，不影响其复制能力

④有标记基因，有利于筛选重组体。

⑤克隆载体上要有复制起点，表达载体上还要有启动子。（2）载体特征根据载体用途分为：克隆载体：携带的外源DNA片段在宿主细胞中增殖、扩大数量。克隆载体上需有复制起始点.表达载体：携带的外源DNA片段或基因在宿主细胞中表达产生RNA和/或蛋白质。表达载体上还需有启动子。常用的载体：

质粒、λ噬菌体、粘粒

PI、BAC、YAC

2）载体分类(1)质粒（plasmid）细菌中独立于染色体外的双链闭环DNA分子。大小约为数千碱基对。天然质粒需经改造才能适用于DNA克隆*插入多克隆位点：人工合成

30bp左右的一段DNA序列，含有多种限制酶的单一切点*插入抗生素抗性基因：如Ampr*建立用于重组子筛选的选择系统，将多克隆位点置于可表达的标志基因中间。

能够携载外源DNA分子＜

10kb

质粒(plasmid)(2)λ噬菌体（lambdaphage）高效感染细菌的病毒DNA分子为线性双链5′末端是12个核苷酸突出的粘性末端，即cos序列。进入宿主细胞后，COS序列碱基配对环化。①置换λ载体:外源DNA片段取代λ噬菌体DNA分子中间部分的基因。

插入片段：9-23kb

常用于制备基因组DNA文库②插入λ载体:外源DNA片段插入λ基因组的CI基因.

插入片段：〈10kb

常用于制备cDNA文库(3)粘粒（cosmid）将质粒和λ噬菌体改建的载体，改造后含λ噬菌体的COS序列以及质粒（plasmid）特性:携带外源DNA分子约30-45kb。(4)P1噬菌体和

P1衍生人工染色体（PAC）P1噬菌体:其DNA为线性，体外包装于蛋白质壳内。P1DNA进入宿主细胞后环化，扩增。携带外源DNA片段约100kb将P1噬菌体和F因子结合构成了PAC，携带外源DNA片段约130-150kb

。(5)细菌人工染色体（bacterialartificialchromosome,BAC）

是基于大肠杆菌的F因子构建的、低拷贝的质粒载体。（F因子是大肠杆菌中自然存在的一种致育质粒，编码多种参与复制、分配和接合过程的蛋白质）

BAC分子中携带：抗生素抗性标记、复制子oriS、利于DNA复制的解旋酶（RepE）以及确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座（parA,parB等

）

它不同于一般质粒，能携带外源DNA片段>300kb35YAC的结构特征

1）着丝粒：有丝分裂姊妹染色单体分离之必需。2）端粒：保护染色体末端免受核酸酶侵袭。3）自主复制序列（ARS）元件：染色体自主复制的起点。与外源DNA连接成线性DNA分子，导入酵母细胞克隆。携带外源DNA片段：0.2-2Mb(6)酵母人工染色体（YAC）

（yeastartificialchromosome,YAC）362个端粒1个着丝粒1个自主复制元件（ARS）4细胞—DNA克隆

主要步骤主要有以下步骤

1）分离纯化目的基因

2）构建重组DNA分子

3）宿主细胞的转化

4）含重组体的宿主细胞的筛选、扩增

5）分离重组DNA第一步骤

分离纯化目的基因1.

化学合成目的基因

2.从基因组DNA文库中获取

3.从cDNA文库中获取

4.用聚合酶链反应（PCR）合成

第二步骤：构建重组DNA分子选择适当的载体；将目的DNA和载体DNA分别经某种限制性内切酶消化后，将二者置于一个反应体系，相同粘性末端借氢键互补连接（粘性末端一般为4个核苷酸，氢键比较弱，只能在低温维持）。连接酶（ligase）使两个分子以共价键连接（形成磷酸二酯键），构成重组DNA分子。

第三步骤：宿主细胞的转化（transformation）目的DNA片段与载体连接构成的重组体，导入适当宿主细胞的过程称为转化。感受态细菌（competentcell）

细菌细胞膜具有选择通透性，不允许大分子通过。当细菌先暴露于高离子强度溶液(CaCl2)或经短暂电休克等作用后，其通透性增高，部分细菌能从环境中摄入外源DNA，称感受态细胞。转化第四步骤：含重组体的宿主细胞的筛选、扩增

将转化后的液体涂布于琼脂培养基表面：培养基中含有宿主菌敏感的抗生素；

载体分子中含有相应抗生素的抗性基因，只有导入载体的细菌才能在培养基上生长；

导入的载体是自身环化还是含有目的片断的重组载体，有待进一步筛选。筛选有多种方法，蓝白筛选是其中常用的一种。载体中还含有标志基因-β-半乳糖苷酶基因片段，其产物与缺陷株细菌产生的另一部分半乳糖苷酶产生α互补，使培养基中无色的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)转化为蓝色物质。

多克隆位点（multiplecloningsites,MCS）设计在标志基因内，MCS本身不影响标志基因表达。外源DNA片段插入MCS后，标志基因表达丧失—插入失活。可区分仅含载体的宿主菌（菌落为蓝色）和含重组DNA的菌落（菌落为无色）挑取含重组DNA的菌落，置液体培养基中培养。得到大量含重组DNA的细菌第五步骤：分离重组DNA收获扩增后的培养细胞，提取重组DNA分子并纯化。由于一个感受态细菌细胞最初常常仅摄取一个重组DNA分子，纯化的重组DNA分子完全一致，称DNA克隆。通过酶切方法获得目的DNA片段，测序鉴定。DNA克隆53DNA文库（DNAlibrary)：指通过DNA克隆(重组)技术人工构建的包含某一特定来源DNA所有片段的重组DNA克隆总和。DNA来源不同：可构建不同的DNA文库1.基因组DNA文库2.cDNA文库5DNA文库（DNAlibrary）

1）基因组DNA文库（genomicDNAlibrary）应用DNA重组技术构建的含有基因组全部DNA序列的DNA克隆总和。DNA来源：人类几乎所有细胞的核基因组DNA相同，可用易得到的外周血细胞DNA制备基因组DNA文库。基因组文库具有种属特异性，但无组织特异性

2）cDNA文库（cDNAlibrary）不同组织及不同发育阶段的细胞基因表达不同。以来源于特定（类型或发育阶段）组织的mRNA为模板，用逆转录酶合成cDNA；与含有某一种限制酶切点的双链寡核苷酸接头连接后，用该酶切割成粘性末端，与载体连接后转化宿主细胞,由此得到的所有阳性菌落总和,称该组织的cDNA文库.cDNA文库既有种属特异性，也有组织特异性。可从某一特定组织的cDNA文库中分离该组织表达的基因.

cDNA文库构建DNA文库意义文库建立后，可从中筛查分离所需的目的基因或cDNA核酸杂交：将菌落原位印迹在硝酸纤维素膜上，用同位素标记的特异性DNA探针同膜杂交，放射自显影后可以确定插入特异DNA片段的克隆菌。

cDNA文库通过特异性抗体或配体筛查表达性cDNA

文库，可得到含有相应cDNA的克隆菌6目的基因表达

将目的基因与表达载体重组，导入宿主细胞表达出相应基因产物RNA或蛋白(如胰岛素,干扰素,特异基因的抗原等）-----目的基因表达

表达载体的主要组成成分：

多克隆位点强的可诱导的启动子复制起点

核糖体结合位点下游有转录终止序列重组表达载体（1）在细菌中表达真核细胞基因的基本要求①由于缺乏转录后加工机制，真核细胞基因不能直接在细菌中表达。

将编码特定多肽的目的cDNA插入表达载体1）原核表达体系②表达系统常需构建可诱导的启动子大量外源蛋白或多肽对宿主细胞本身有害。开始时大量培养含有重组DNA的宿主菌，无外源基因表达。而后将诱导物加入细菌培养物，启动插入基因表达，使细菌短时间内表达多肽或蛋白产物，收获细菌并提取表达产物。

产物特征：细菌内缺乏翻译后加工机制，多肽常不稳定，产物活性有限或无活性。

2).真核表达体系

如酵母、昆虫及哺乳类动物细胞

优点：可表达克隆的cDNA及真核基因 可适当修饰表达的蛋白质产物较稳定且具有功能活性

缺点：操作技术难、费时、不经济

二、PCR-DNA克隆聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）PCR：模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶反应，体外程序化的特异性扩增某一DNA片段的技术

1.PCR的基本原理 1）PCR反应中的主要成份特异性引物、dNTP、模板DNA、热稳定的DNA聚合酶及含有Mg2＋的缓冲液。

（1）引物：PCR首先需要合成一对与目的DNA序列两侧互补的寡核苷酸作为引物（primer）一般长度为18-25bp引物的作用是限定扩增目的DNA，达到选择性和特异性DNA克隆的目的。

PCR的基本原理（2）PCR必需有DNA合成的原料（dNTP），

dATP

dCTP即4种脱氧三磷酸核苷：

dGTP

dTTP

PCR的基本原理（3

）模板DNA：其数量和纯度影响PCR产物.

一般反应中的模板数量为102-105个拷贝,模板量过多则可能增加非特异性产物.DNA中的杂质也会影响PCR的效率。

PCR的基本原理（4）热稳定的DNA聚合酶：常用TaqDNA聚合酶。

（5）含有Mg2＋反应缓冲液：影响DNA聚合酶的活性

PCR的基本原理2）PCR的基本反应步骤： （1）变性：93℃-95℃，模板DNA完全变性成为单链； （2）复性：50℃-70℃，引物与模板DNA退火结合；（3）延伸：70℃-75℃，DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应。 上述三个步骤为一个循环.

PCR的基本原理PCR是链式反应：每个周期合成的新链可作为下一周期合成DNA的模板，循环扩增DNA。反复n个周期，可扩增2n倍DNA。经25～30次循环后，可获得百万倍以上的目的DNA。

PCR扩增的DNA量足以直接通过溴化乙淀染色后紫外灯下观察。

PCR扩增NGF基因（大鼠）ratbeta-nervegrowthfactorsequence5’-301gttctacactctgatcacagcgtttttgat

cggcgtacag

gcagaaccgtacacagagat361caatgtcccagagggagactctgtccctgaagaccactggactaaacttcagcattccct421ctgacacagccctacgcagagcccgcagtgcccctgctgaaccaatagctgcccgtgtgac481agggacgacccgcaacatcactgtggaccccaaactgtttaagaaacgga

gactccgttc541

accccgcgtgctgtttagcacccagcctcccaaactgtttaagaaacggagactccgttc

-3’Perim1:(5’)gatcggcgtacaggcagaac(3’)328-347Perim2:(3’)cgcggggtgaacggagtctc(5’)529-548

预期扩增长度：220bpPCR过程

DNAMarkerNGF←200bp←100bp220bp→2PCR的特点快速：PCR一个周期仅为3-5分钟，经过30个周期约几个小时，可得到足量的目的DNA用于分析灵敏：PCR能够扩增少量目的DNA，甚至单个细胞DNA，有助于极少量标本的研究；如法医学物证、分子病理学、产前基因诊断等。适用样品广泛

：有时标本是混杂物，难以分离DNA或DNA部分降解，如化石标本、福尔马林固定的标本等。3PCR局限性产物片段短小：一般小于5kb②一定的错配率:

高保真Taq酶可大大降低错配率；它适合对PCR保真性要求较高的实验，如基因筛选、测序、突变检测等

③产量有限：单一PCR反应中克隆的DNA量有限，且有时不适合某些后续研究。可利用细胞克隆体系来克隆PCR产物。获得大量目的DNA进行各种分析。

PCR产物的TA克隆4PCR应用应用：

非常广泛

各种生命现象的生理、病理机制的研究疾病诊断法医学考古学等5常用的几种改进PCR方法1）

巢式引物PCR是一种增加PCR反应特异性的方法。为二轮PCR。第一轮扩增反应产物稀释，作为第二轮反应的起始DNA模板。第二轮PCR需另设反应体系，并应用另外的引物（位于初级PCR引物的内侧）。巢式引物PCR采用两对引物进行PCR，其中第二对引物位于第一对引物内侧P1上P1RP2上P2RP1FP2F以初级PCR产物为模板，进行第二步PCR，只有初级PCR中特异的扩增片段，才能被二级引物扩增。达到增效、提高产物特异性的目的。2）多重PCR

同一PCR反应体系中加入数对引物，可同时扩增多种DNA片段。要求：引物复性温度相近；所覆盖的区域不重叠；扩增产物大小不同。应用:同时检测同一基因内多个外显子缺失

在检测基因同时设置内对照。

3）逆转录PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）：原理：提取组织细胞总RNA，用oligo-dT或随机引物，在逆转录酶的作用下将其中mRNA反转录成cDNA；再以cDNA作为模板，通过特异性引物，PCR扩增目的基因。实验需设内对照，引物设计要跨内含子。应用：检测基因表达水平，属于半定量检测。获取目的基因的cDNA：用于合成cDNA探针或构建表达载体等4）实时荧光定量PCR(Realtime–PCR):指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监