第6章-常用分子生物学技术

第六章常用分子生物学技术蔡卫斌生物化学教研室caiwb@第一节分子杂交技术具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知核酸序列称探针。在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。双链间氢键的断裂！2、DNA变性的本质1、DNA变性的概念核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)

。变性复性

DNA-DNA杂交双链分子核酸分子杂交探针技术探针(probe)

一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。一、Southern印迹此技术由Southern1975年首先设计。被检测对象为DNA。带有DNA片段的凝胶DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳至膜（尼龙膜或硝酸纤维素滤膜）上转膜杂交、显影凝胶滤膜用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印迹杂交的技术流程从凝胶上转移DNA二、Northern印迹应用DNA探针检测特异mRNA的一种杂交技术，主要用于分析mRNA的转录或mRNA分子大小。其方法类似于Southern印迹杂交。三、Western印迹将待检测蛋白质（或酶）经SDS电泳并染色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗原”免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。三种

印迹比较1.DNA印迹技术(Southernblotting)检测DNA2.RNA印迹技术(Northernblotting)检测RNA3.蛋白质的印迹分析(Westernblotting)检测蛋白质三种印迹技术的比较四、原位杂交(insituhybridization)1、定义：

将标记探针与细胞或组织中核酸按碱基配对原则进行特异性杂交，并应用组织化学或免疫组织化学方法在显微镜下进行细胞内定位或基因表达的检测技术称原位杂交（hybridizationinsitu)。

2、操作步骤：

载片的清洁与处理；组织与细胞的固定；探针；湿盒荧光原位杂交五、生物芯片chip生物芯片（biochip）是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术。是将核酸、多肽或蛋白质分子、组织切片和细胞等制成探针，以预先设计的方式有序地、高密度地排列在玻片或硅片等载体上，构成二维分子阵列，然后与待测生物样品靶分子杂交，通过检测杂交信号实现快速、高效和高通量样品检测。因该技术常用玻片或硅片等材料作为固相支持物，且在制备过程中模拟计算机芯片的制备技术，所以称之为生物芯片。其原理也是分子杂交技术。微型化高通量—提高信息量平行化—提高信息的可比性微量化—降低待检样品用量自动化—提高工作效率低成本—可迅速普及推广生物芯片技术的特点生物芯片使用步骤芯片制作把探针固定于载体表面样品处理目标分子富集分子间的杂交结果检测与数据分析生物芯片分类（1）基因芯片（2）蛋白质芯片（3）细胞芯片（4）组织芯片基因芯片概念：基因芯片，也叫DNA芯片，是将大量特定序列的DNA片段（分子探针）有序地固定在经过处理后的尼龙膜、玻璃片、硅片等支持物上，从而能快速、准确地对大量DNA分子序列进行测定和分析的一种类似电脑的芯片。原理：利用碱基的互补配对原则（DNA分子杂交）材料：分子探针，尼龙膜，玻璃片，硅片1、基因芯片制作基因芯片的大致步骤可在基因组水平进行基因表达和发现研究、突变、序列测定等，已方泛应用于基因组研究和人类疾病的诊断等多领域。基因芯片应用应用基因微矩阵芯片研究宫颈癌相关基因表达DNA微点阵已广泛和流行的用于疾病诊断、基因组比较、以及新型癌症的分类。2、蛋白质芯片蛋白质芯片（proteinchip）,又称蛋白质微阵列，是指以蛋白质或多肽作为配基，将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白质之间或蛋白质与其它分子之间的相互作用关系。蛋白质芯片技术在医学中的应用特异性抗原抗体的检测生化反应的检测疾病诊断对疾病分子机制的研究药物筛选及新药的研制开发3、细胞芯片又称细胞微阵列，是以活细胞为研究对象的一种生物芯片，在芯片上完成对细胞的捕获、固定、平衡、运输、刺激及培养的精确控制，并通过微型化的化学分析方法，实现对细胞样品的高通量、多参数、连续原位信号检测和细胞组分的理化分析等。

4、组织芯片组织芯片,又称组织微阵列，是将不同生物体的组织按预先设计或研究需要排列在固相载体上所形成的组织微阵列。组织芯片最大的优势在于可以对大量组织标本同时进行检测，只需一次实验过程即可完成，缩短时间，减少误差，提高了可比性。

第二节目的基因制备技术一、聚合酶链式反应（PCR）

概念

聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）是一种体外扩增特异DNA片断的技术,能在短时间内获得数百万个特异DNA序列的拷贝。（一）PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR耐热DNA聚合酶的应用，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖KaryMullis“我不大喜欢动手,我宁肯不动手,我不喜欢做费力的事。作为一个发明家,重要的一点是为解决某些问题而尽力设计一个简捷的动手方案。”1、PCR扩增DNA片段的原理

PCR是在模板DNA、引物和四中脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应，整个扩增过程分三步：（二）PCR技术的基本原理和操作①

变性：加热，模板DNA形成两条单链②退火：降温，模板单链DNA与引物配对结合③延伸：在DNA聚合酶及镁离子等存在的条件下，引物3'-端向前延伸，合成与模板配对的新链

上述三步为一个循环，经过一个循环DNA量增加一倍。新合成的链又可以成为新一轮循环的模板，经过25-30个循环后目的DNA就可以扩增106~109倍。通过循环可以提高PCR的特异性。1）模板DNA2）特异性引物3）耐热DNA聚合酶4）dNTPs5）Mg2+6）缓冲液2、PCR的基本成份模板DNA95℃3、PCR的基本操作PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束95℃第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束是不是循环次数越多越好？PCR扩增的平台效应引物设计（1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制PCR技术的优点特异性强灵敏度高操作简单、省时对待检原始材料质量要求低高效率的基因扩增技术引物引物3’5’5’5’基因组PCR技术的特点：扩增特异的DNA片段1、目的基因的克隆2、基因的体外突变3、DNA和RNA的微量分析4、DNA序列测定5、基因突变分析（三）PCR的主要应用实时PCR技术原理逆转录PCR（RT-PCR）以细胞内总RNA或mRNA为材料进行体外扩增的技术。主要用于克隆cDNA、合成cDNA探针，检测RNA病毒、分析基因表达等逆转录生成cDNA方式：以随机进行的PCR扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物以oligo(dT)作为引物，mRNA3`末端polyA尾与之互补以人工合成的随机序列六核苷酸混合物作为引物，进行扩增。reversetranscription逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增二、cDNA文库cDNAlibrary一个生物体的基因组DNA用限制性内切酶部分酶切后，将酶切片段插入到载体DNA分子中，所有这些插入了基因组DNA片段的载体分子的集合体，将包含这个生物体的整个基因组，也就是构成了这个生物体的基因文库(genelibrary)。

cDNA文库是以特定的组织或细胞mRNA为模板，逆转录形成的互补DNA（cDNA）与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌形成重组DNA克隆群，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库。

cDNA文库具有组织或细胞特异性。

cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。（一）从cDNA文库建立基因组DNA文库1）制备靶基因的核酸探针2）若靶基因表达蛋白已知，可反推部分基因序列，制备寡核苷酸探针3）差异显示杂交（二）cDNA文库目的基因的筛选

利用核酸分子杂交分离目的基因：差异显示杂交不需要核苷酸序列信息，而耍拥有两种不同的细胞群体：目的基因正常表达细胞群和在基因不表达细胞群。制备两种不同mRNA提取物，一是含有目的基因mRNA的总mRNA群体，一是不含有目的基因mRNA种的总mRNA群体。因此，可以通过这两种总mRNA(或是它们的cDNA拷贝)为探针的平行杂交，对由表达目的基因的细胞总mRNA构建的克隆库进行筛选。当使用存在目的基因的mRNA探针时，所有包含着重组体的菌落都呈阳性反应，在x光底片上呈现黑色斑点，而使用不存在目的基因的mRNA探针时，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈阳性反应，在x光底片上呈现黑色斑点。比较这两种底片井对照原平板，便可以挑选出含目的基因的菌落。1）在基因组水平上研究某基因对器官、组织和细胞在个体发育中的影响2）cDNA文库的筛选比较简单易行，尤其适用于某些特殊组织基因的制备3）由于每一个cDNA克隆都包含一种mRNA序列，这样在筛选中出现假阳性的概率就会很低4）为了测定mRNA序列，利用它的cDNA拷贝序列就可以有效分析外显子的基因结构（三）cDNA文库的优越性由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。三、化学合成化学合成法主要应用作为核酸分子杂交探针作为引物，用于测序和PCR用于制备小的基因、不易获得基因或用于改造天然基因作为DNA末端改造中的接头用于制备cDNA，筛选克隆基因，或基因定位或基因的定点突变第三节基因敲除技术基因敲除（gene

knock

out）又称基因剔除，或基因打靶

（gene

targeting）是指通过DNA定点同源重组，定向改变基因组中的某一特定基因，使机体特定基因失活或缺失，从而研究此基因的功能的一种分子生物学技术。由于胚胎干细胞的这种特殊性，ES细胞基因打靶技术已被广泛地应用于建立转基因动物之中。从80年代到90年代初，小鼠ES细胞基因打靶技术已发展到成熟阶段。1984年，Bradly等成功地用显微注射法将ES细胞移入囊胚腔，并移植回假孕母鼠，获得生殖系嵌合体，再适当交配，获得源于ES细胞系纯系小鼠。基因敲除的发展历程此实验首次证实体外培养的ES细胞能在体内分化发育成生殖系嵌合体并可获得小鼠纯合体子代。1987年，人们利用ES细胞技术建立了次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)基因敲除(Geneknockout)的动物模型。转抗凝血酶素VⅢ基因、转β-干扰素基因羊。如何敲除其胰岛素基因，成为糖病模型？猴的基因编码与人类只有1%的差别，通过转基因猴，可以研究各种疾病对人的影响，并开发出相应的治疗方法。如引进老年性痴呆病的基因，加快针对这种疾病疫苗的开发研究。还可引进糖尿病、乳腺癌、帕金森氏症等基因，为人类最终战胜社些疾病提供帮助。一、基因敲除的一般原理利用胚胎干细胞进行基因敲除。1）构建常规基因敲除载体，载体中的外源基因与靶基因高度同源，且被修饰和改造；2）敲除载体质粒导入胚胎干细胞；3）筛选发生同源重组的阳性胚胎干细胞；4）通过显微注射将阳性胚胎干细胞导入胚囊；5）转入假孕雌鼠子宫；6）获得嵌合体小鼠。发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组（generalrecombination）。通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。同源重组是最基本的DNA重组方式Holliday模型的4个关键步骤：两个同源染色体DNA排列整齐；一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体；通过分支移动产生异源双链DNA；Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：

内切酶

(recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移

(recA)

内切酶(recBCD)

DNA

连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´3´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)

DNA连接酶

DNA连接酶片段重组体拼接重组体

knock-out

：thegeneofinterestisdisrupted

同源重组抗性选择RBDT-ADT-Ahpt△EnLBWaxy重组整合Waxyhpt△EnWaxy×重组intron1表达载体受体基因组打靶结果基因打靶（genetargeting）二、基因敲除载体构建获得目的基因的同源片段，即5`-臂和3`-臂。打靶载体的选择性标记基因质粒筛选抗性基因：AmpR，KanR阳性筛选基因表达：转染后的细胞存活，最多见Neo阴性筛选基因表达：转染后的细胞死亡，DTA，HSV-TK1、插入性载体(gene-insertion

vector)：插入型载体中与靶基因同源的区段中含有特异的酶切位点，线性化后，同源重组导致基因组序列的重复，从而干扰了目标基因的功能。基因敲除载体类型获得目的基因的同源片段，即5`-臂和3`-臂。2、置换型载体(gene-replacement

vector)：断裂位点位于同源序列区域的外侧或两侧，选择基因位于同源目的序列内部或外侧。基因重组时以载体的同源序列取代染色体靶位序列，载体DNA

同源目的序列与染色体靶位点进行两次同源重组。目前，大多数基因敲除都采用置换型载体。取代型（a）或插入型（b）载体三、基因敲除载体导入ES细胞1、ES细胞的获得现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。常用的鼠的种系是129及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。ES能在体外培养，保留发育的全能性！常用于基因敲除的靶细胞是小鼠ES细胞。导入方式有显微注射法、电穿孔法、精子载体法和逆转录病毒法等，目前应用较多的是电穿孔法。

2、重组DNA导入ES（1）显微注射法(Microinjectiontechnique)显微镜下，用一根极细的玻璃针（直径1-2微米）直接将DNA注射到胚胎的细胞核内，再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。用这种方法生产的动物约有10%是整合外源基因的转基因动物。缺点：一次只能转一个细胞（2）电穿孔法在高压电场的短暂作用下，细胞膜上可出现可逆的孔洞，外源DNA可通过此孔洞进入胞内。虽然转染效率低于显微注射法，但可以大量细胞转染，便于筛选，方法稳定，目前应用最多。（3）DNA-磷酸钙共沉淀法将DNA与CaCl溶液混合，再缓慢滴加入含有磷酸的HEPES溶液中，形成DNA-磷酸钙共沉淀颗粒。小心地将颗粒加入到培养的靶细胞表面，保温数小时后，使DNA被靶细胞摄取。（4）DEAE-右旋糖苷法该法先用来促进病毒DNA导入，后来发展为一种哺乳动物细胞的基因转移方法。方法：用外源DNA和DEAE-右旋糖酶的混合物处理细胞。常用于克隆化基因的瞬间表达，不用于细胞的稳定转化。（5）逆转录病毒载体逆转录病毒是一种RNA病毒，基因大小为3-10kb。不同于其它病毒，它具有二倍体基因，即含有两个相同的RNA分子，有典型的真核mRNA结构（包括帽子和尾巴）。缺点：片段不能太长四、筛选与鉴定由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动物的重组概率为10-2～10-5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。目前常用的方法是正负筛选法（PNS法，Positive-NegativeScreening），标记基因的特异位点表达法以及PCR法。应用最多的是PNS法。正负双向筛选系统：（

positive

and

negative

selection，PNS），PNS采用置换型载

体，该载体含有正负选择基因各一个，正向选择基因多为neo基因，插入载体的同源序列中；负向选择基因常用DTA基因，置于同源序列的外侧。同源重

组时，载体的同源区发生重组，同源区以外部分将被切除，所以在同源重组时，DTA基因将被切除而丢失。而在随机整合时，所有序列均保留。

1、正负筛选法（PNS）1）在随机插入的情况下，如果有DTA表达，DTA可以直接杀死细胞。2）在同源重组时，细胞对

G418有抗性，随机整合时只对G418有抗性。3）未进行任何方式整合的细胞则被G418杀死。neoDTAPNS载体目标基因neo××同源重组结果一、同源重组neoDTAneoDTAPNS载体

基因组随机整合结果二、随机整合正负筛选法（PNS法）筛选已发生同源重组的细胞2、正向筛选法正向筛选标记基因Neo具有双重作用，一方面导致了靶基因的插入突变；同时作为重组细胞的正向筛选标志，该基因产物可使细胞在含有新霉素的培养

基中生长。正向筛选法可分为无启动子筛选法、无增强子筛选法和无polyA筛选法。

（1）启动子缺失筛选法原理是在重组基因载体的目的片段中插入一个启动子缺失的正向选择基因

neo

neomycin，同时，目的基因片段也不包含该基因的启动序列。如果基因载体和细胞基因组发生同源重组，则正向选择基因可以在靶位点基因启动子的作用下

得以表达，使阳性细胞具有

G418

抗性，从而在选择培养基中得到同源重组阳性克隆。（2）Poly-

A缺失筛选法Poly-A缺失筛选的载体设计与启动子缺失的设计基本相同，当打靶基因不能被诱导表达时，则考虑选用poly-

A缺失敲除策略。Poly

-

A

缺失的正向选择基因

neo位于载体目的片段中,

由于neo

基因转录终止信号的缺失,其表达受到抑制。在重组阳