质谱数据分析2012

从质谱数据鉴定多肽/蛋白质邵晨KeyadvantageofproteomicsResearchersworkonthelevelofgeneproductsanddealwithgenesthatarereallyexpressedtogiveadetectablePRODUCTandarenotjust"expressed“whichonlysaystheyproduceadetectablemRNAbutitisnotclearwhetherthereisageneproductornot.KeylimitationofproteomicsUsually,onlyafractionoftheproteinssynthesizedcanbedetectedinaproteomicsexperiment,whereastheexpressionofALLgenescanbemonitoredinawhole-genomearrayexperiment.KeyprerequisiteofproteomicsAgenomesequencefortheinvestigatedorganismoratleastacollectionofmanycDNAsequencesisrequired.Yogita

Mantri&Arvind

Gopu’spresentation,2003

把单个蛋白/多肽从复杂样品中分离出来非常困难，在“组学”实验中一般达不到这个效果MALDIm/zspectrumofapeptidemixtureThe

QuadrupoleThequadrupoleconsistsoffourparallelmetalrods.

Ionstraveldownthequadropoleinbetweentherods.

Onlyionsofacertainm/z

willreachthedetectorforagivenratioofvoltages:otherionshaveunstabletrajectoriesandwillcollidewiththerods.Thisallowsselectionofaparticularion,orscanningbyvaryingthevoltages.

sourcedetectorVoltageFiltersoutallm/zvaluesexcepttheonesitissettopassObtainsamassspectrumbysweepingacrosstheentiremassrangeCollectsandstoreionsinordertoperformMS-MSanalysesonthem.IonTrapMassAnalyzerTrappedionsIonsinIonsoutThetrapconsistsofatopandabottomelectrodeandaringelectrodearoundthemiddle.Ionsareejectedonthebasisoftheirm/zvalues.Tomonitortheionscomingfromthesource,thetrapcontinuoulsyrepeatsacylcleoffillingthetrapwithionsandscanningtheionsaccordingtotheirm/zvalues.Separatesthemassanalysisandionisolationeventsintime(usingasinglemassanalyzer)Ionizationiontransfer/trappingparentionisolation/fragmentationdaughteriondetectionAmassanalyzerfordeterminingthemass-to-chargeratio(m/z)

ofionsbasedonthecyclotronfrequencyoftheionsinafixedmagneticfield.Allionsaredetectedall

ions

are

detected

simultaneously

over

some

given

period

of

timeIonsareinjectedintoamagneticfield,thatcausesthemtotravelincircularpaths.ExcitationwithoscillatingelectricalfieldincreasestheradiusandenablesafrequencymeasurementFourierTransformMS

Fourier

transform

ion

cyclotron

resonance

mass

spectrometry,FTICMSICRcanbeusedwithdifferentionizationmethods,ESI,MALDIAshortsweepoffrequenciesisusedtoexciteallions.Thecomplexspectrumofintensity/timeisanalyzedwithFourierTransformtoextractthem/z

componetsHighresolutionHighaccuracyVerysensitive(theminimalquantityfordetectionisinorderofseveralhunderedionsNondestructive–theionsdon’thitthedetectionplatesotheycanbeselectedforfurtherfragmentationOrbitrap静电轨道阱质谱傅里叶变换原理MassSpectrometryReviews，Volume27,Issue6讲座大纲本讲座中，将讲述三种鉴定蛋白质的方法。1。质量纹鉴定法（PeptideMassFingerprinting）2。二级质谱的手工鉴定法（DenovoSequencing)。3。二级质谱的数据库搜索鉴定法（MS/MSDatabaseSearching）。鉴定多肽的流程多肽混合物分离质谱仪一级质谱质量纹选择高峰鉴定多肽质谱仪二级质谱手工鉴定数据库搜索鉴定多肽多肽质量纹鉴定多肽质量纹（PeptideMassFingerprinting，PMF）是从一级质谱（MS）中鉴定多肽的主要方法。多肽质量纹一般都用于分析2DE-MS的结果，不适宜分析多个蛋白质的混合物。其原理就是利用了蛋白序列数据库中的多肽质量的信息。一级质谱图蛋白质经过酶解后，送入质谱仪，得到一级质谱。从一级质谱鉴定蛋白质的算法（质量纹）主要用在MALDI-TOF产生的质谱图上。目前来说，由MALDI-TOF质谱仪产生的质谱图精度较高。另一个问题是，ESI产生的质谱图中的离子通常带有很多电荷，而MALDI质谱图中的离子一般只带一个电荷，比较容易计算。蛋白序列数据库在网上可以查询到最新的蛋白序列数据库，如IPI，swissprot等等下载FASTA格式ProteinsequencedatabaseUniprot（包含Swissprot和Tremble）Integr8FASTA格式的数据库FASTA格式包含蛋白的名称和氨基酸序列。虚拟酶解有了蛋白序列的信息，我们就可以进行鉴定。对应于送进质谱仪的样品，首先找到数据库里的序列的酶切位点。质量排列这样可以产生一系列的多肽，我们可以计算每个多肽的分子量。最后一个R的质量多加了18，这是因为我们写在下面的是残基的分子量。质量排列把所有多肽的分子量排序。质量纹如此，质谱图上的质量就可以与多肽上的质量相匹配。质量纹这就是多肽质量纹（PMF）的最基础的思路。但是，真正的将之作为一个鉴定蛋白质的方法，还有很多需要考虑的问题。PMF中的问题第一个问题：质量相近的多肽怎么处理？在现实的蛋白数据库中，多肽的数量是很庞大的。这里面难保不会有质量非常相近的多肽。这样，就造成了质谱图上的一个峰可能匹配不止一个多肽，于是我们就难以知晓这张质谱图究竟代表哪个蛋白。质量相近的多肽多肽[M+H+]DGAPLESSSR1019.0490REGESTPSR1019.0520DFPIANGER1019.0940DPLASSSWR1019.0940YVPLKDQR1019.1800HLQLPAPSR1019.1830VLFLNGIDK1019.2200Peakm/z:1019.08解决方案第一个解决的办法是限制用来搜索的数据库。比如，你如果做的试验用的是小鼠的组织，那么你可以只在小鼠的数据库中搜索，这样就可以减低出现这种情况的可能性。第二个解决的办法是要求必须有多个多肽和数据库相匹配，才做出最后的蛋白质鉴定。多匹配DFPIANGER 1019.09EPISVSSQQMLK 1347.56VLDALDSIK 974.13CarbonicanhydraseII

SHHWGYGKHBGPZHWHKDFPIANGERQSPVNIDTKAVVQDPALKPLALVYGEATSRRMVNNGHSFNVEYDDSQDKAVLKDGPLTGTYRLVQFHFHWGSSBBQGSEHTVDRKKYAAELHLVHWNTKYGDFGTAAQQPDGLAVVGVFLKVGDANPALQKVLDALDSIKTKGKSTDFPNFDPGSLLPNVLDYWTYPGSLTTPPLLESVTWIVLKEPISVSSQQMLKFRTLNFNAEGEPELLMLANWRPAQPLKNRQVRGFPK多匹配可以大大降低随机匹配的概率,从而增加结果的可信度长蛋白和短蛋白第二个问题：长蛋白可能会更容易的被匹配。因为长蛋白里的多肽数目较多，以概率来算，匹配上的几率也会比较大。质量纹算法必须考虑这个问题，给短蛋白一定的补偿。多个蛋白的情况第三个问题就是在一张质谱图中可能有多个蛋白存在。通常，MALDI-TOF是与双向电泳连接使用。双向电泳的一个电泳点上可能有2-3个蛋白，这样就增加了鉴定的难度。由于无法预知一个电泳点上有多少蛋白质，PMF的效果可能会受到很大的影响。多肽质量纹：小结质量纹算法是用一级质谱鉴定蛋白质的经典方法。质量纹算法的效果受到很多方面的限制，首先是仪器精度的限制，其次是样品中可能有多个蛋白的限制。这使得质量纹算法不是理想的分析复杂混合物中蛋白成分的方法。讲座大纲利用二级质谱图我们刚才谈到了，多肽质量纹有其先天的不足。其中，最糟糕的是它不能处理多个蛋白的混合物。如果我们能够处理混合物，就可以减少很多用于纯化上的时间和精力。那么，怎么才能从混合物中鉴定蛋白呢？这就要用到二级质谱。FromNesvizhskii’slectureatISB利用二级质谱图在一级质谱图中，选择其中的一个峰（母离子），再把这个离子打碎（CID，ECD…），检测碎片离子的m/z，就得到一张二级质谱图。这里的假设是一级质谱中的一个峰就对应了一个多肽。FromJimmyEng’slectureatISB

MolCellProteomics.2011Nov;10(11):R111.009522.利用二级质谱图对于一张一级质谱图，可以选择多个峰进行二级质谱的操作。这样就可以适应样品里有多个蛋白的情况。鉴定多肽的流程多肽混合物酶解分离质谱仪一级质谱质量纹选择高峰鉴定多肽质谱仪二级质谱手工鉴定数据库搜索鉴定多肽典型二级质谱图CIDCID，即Collision-inducedDissociation，是通过撞击使得多肽的肽键断裂的过程。在做二级质谱的试验时，质谱仪选择一级质谱中的一个峰，也就是对应质荷比的这些离子，让这些离子高速撞击质谱仪中的惰性气体，使其肽键断裂，这就是CID。FromJimmyEng’slectureatISB

a,b,y系列离子最常见幻灯片57b1b2b3y1y2y3LFGKRelativeIntensitym/zFLGK++FLGK++FLGK++CIDFLGK++FLGK++FLGK++b1b2b3y3y2y1FLGK++FLGK+TheoreticalCIDofaTrypticPeptideKGLFMS/MSSpectrumParentions(464.29)DaughterionsNon-dissociatedParentions一些常见的特殊情况Neutralloss:某些酸性氨基酸可能会在CID中丢失一个水分子（H2O），而碱性氨基酸会在CID中丢失一个氨分子（NH3）。Immoniumions:氨基酸在CID过程中可能产生形如H2N=CHR+的Immoniumions（亚胺离子）。根据immoniumions可以判断哪些氨基酸在多肽中存在。一些常见的特殊情况翻译后修饰：有时，二级质谱中需要考虑某些氨基酸可能被修饰（磷酸化、糖基化等），这些修饰可能改变残基的分子量。NeutralLoss和ImmoniumIons表AminoAcidNeutralLossImmoniumIonsA

44G

30S1860P

70V

72T1874C3476L/I

86N1787D1888Q17101K17101E18102M48104H

110F

120R17129Y

136W

159AminoAcidNeutralLossImmoniumIons通过二级质谱图手工鉴定多肽序列九步鉴定法1。寻找immoniumions。2。寻找b2ion。3。寻找y1ion。4。寻找yn-1ion。5。顺着yn-1,yn-2,…的顺序继续寻找y系列的离子。6。顺着b2,b3,…的顺序继续寻找b系列的离子。九步鉴定法7。计算多肽的分子量。8。检查鉴定的结果。9。试着解释更多的峰。氨基酸质量速查表

注意我们给出的是残基的分子量CodeResidueMassG57A71S87P97V99T101C103L/I113N114D115K/Q128E129M131H137F147R156Y163W186CodeResidueMassb2离子的m/z表

GASPVTCL/INDQ/KEMHFRYWG115

A129143

S145159175

P155169185195

V157171187197199

T159173189199201203

C161175191201203205207

L/I171185201211213215217227

N172186202212214216218228229

D173187203213215217219229230231

QK186200216226228230232242243244257

E187201217227229231233243244245258259

M189203219229231233235245246247260261263

H195209225235237239241251252253266267269275

F205219235245247249251260262263276277279285295

R214228244254256258260270271272285286288294304313

Y221235251261263265267277278279292293295301311320324

W244258274284286288290300301302315316318324334343347373例子M+2H=1295.0Da鉴定1。寻找Immoniumions：没有找到。2。寻找b2ion：261.8。由于有234.0的a2ion和1033.3的yn-2ion，故肯定b2ion为261.8。3。寻找y1ion：由于已知多肽是由胰酶(Trypsin)酶解，故而C末端只能是K或R，所以虽然找不到y1ion，但是可以在1148.8处找到对应于K的bn-1ion。CID鉴定4。寻找yn-1ion：已经找到了。5。继续寻找y系列的离子：从1033开始，可以分别找到934，748，633，532和461作为y系列的离子，把它们写出来：鉴定6。继续寻找b系列的离子：从834.9开始，似乎只有1019.7一个离子没有鉴定了，它与1148.8之间形成一个氨基酸E，但与834.9之间相差185Da。可以通过b2离子的m/z表查到对应的氨基酸序列：有AN,NA,QG,GQ四种序列都满足185Da的条件(这样用的时候注意要减1)。鉴定7。计算多肽的分子量：经计算，多肽的分子量约为1294.6Da，接近测得的分子量1295.0Da。8。检查鉴定的结果：由于没有观测到immoniumions，我们暂时没有辅助信息来帮助我们检查这一鉴定结果。9。试着解释更多的峰：发现817位置的峰是834位置的峰的neutralloss。De-novoSequencing这种仅通过残基来鉴定多肽的方法又称为De-novoSequencing。可以用计算机程序使得鉴定问题自动化，计算机程序的鉴定流程与上面的九步鉴定法略有区别。当我们拥有近乎完美的二级质谱图时，我们可以采用这种De-novoSequencing的办法。但是，实际情况中，我们并没有完美的二级质谱图。我们已经从例子中看到，单从质谱图不一定能得到全序列。返回DatabaseSearching实际情况中，单从质谱图不一定能得到全序列。

但是，幸运的是，我们还有蛋白序列数据库。所以我们可以从数据库里搜索最好的匹配质谱图的多肽，这样就有了二级质谱的数据库搜索算法。鉴定多肽的流程多肽混合物酶解分离质谱仪一级质谱质量纹选择高峰鉴定多肽质谱仪二级质谱手工鉴定数据库搜索鉴定多肽数据库搜索的基础数据库搜索的基础很简单，就是理论质谱图和实验质谱图之间的一个比对。我们刚才讨论了CID的过程，所以我们知道了残基产生的规律，那么，利用这些规律，我们可以对每个多肽产生一张理论的质谱图，用来和试验质谱图进行比对，对它们“相似”的程度做一个评分，分数最高的多肽，我们就认为它是试验质谱图代表的多肽。数据库搜索的流程在一个蛋白序列数据库中，可以找出来的，落在质谱仪检测范围以内的多肽，多达数百至数千万，如果每个多肽都拿来和实验质谱图做比对的话，需要花费的时间是难以接受的。提高搜索速度的关键就是减少搜索的对象数。数据库搜索的流程所以，基本上，所有的数据库搜索算法都包括两个步骤。第一个步骤是筛选数据库里的多肽，找出所有有可能与质谱图匹配的多肽。第二个步骤就是拿这些选出来的多肽去和质谱图进行比对，并输出最高分值的多肽作为一个PSM（Peptide-SpectralMatch）。FromJimm