细胞培养工程 06 细胞培养生物反应器(II)

动物细胞培养

生物反应器1细胞培养工程南开大学4.分子传递现象2细胞培养工程南开大学分子传递的基本物理现象扩散（Diffusion）由于分子碰撞而传递热能所引起的分子随机运动举例：气泡外周液体滞流层内溶解氧分子的扩散3细胞培养工程南开大学对流（Convection）由于流体主体的运动所引起的传递举例：滞流层被从气泡外周置换离开气泡之后，溶解氧分子随液体流动而位移至反应器的其它位置扩散在流体（气体或液体）内部，分子间每秒钟发生数以万亿次碰撞，每次碰撞都会导致溶质和溶剂分子的运动方向改变；分子的扩散速度取决于其大小、形状、温度和流体粘度（流动阻力）；宏观效果：分子从浓度较高区域迁移至较低区域；可类比物理现象热量（温度）流体流动（压力）4细胞培养工程南开大学扩散菲克第一定律（Fick’sfirstlaw）在单位时间内，通过垂直于扩散方向的单位截面积的扩散物质流量与该截面处的浓度梯度成正比，即浓度梯度越大，扩散通量越大扩散物质流量：单位时间内，分子L

通过单位面积的净数量5细胞培养工程南开大学分子L的有效扩散系数分子L沿扩散方向的浓度梯度扩散：室温下物质的扩散系数范围物质与扩散媒介

扩散系数(cm2s-1)6Gasesingases0.1to0.5Gasesinliquids1x10-7to7x10-5Smallmoleculesinliquids1x10-5Proteinsinliquids1x10-7to7x10-7Proteinsintissues1x10-10to7x10-7Lipidsinlipidmembranes1x10-9Proteinsinlipidmembranes1x10-12to7x10-10数据来源：TransportPhenomenainBiologicalSystems(2nded.,2009)细胞培养工程南开大学扩散分子尺度与分子两次碰撞间迁移尺度比较气体：分子大小

远远小于

两次碰撞间迁移尺度液体：分子大小

远远大于

于两次碰撞间迁移尺度7细胞培养工程南开大学扩散Einstein’sEquationx=(2Dt)1/2x迁移距离D有效扩散系数t扩散时间8细胞培养工程南开大学应用估算细胞内分子相结合（相遇）所需时间采用偏微分方程积分方法，计算静态液相蛋白质分子或病毒颗粒与固定的配基、受体或细胞相结合的累积量，以优化检测方法对流（流动）由于重力、压力或剪切力的存在，流体（气体或液体）主体发生流动，溶于其中的溶质随之移动；溶质的扩散现象同时存在如果流体流动相对比较慢，溶质的扩散现象对其传递起主导作用；如果流体流动相对比较快，液体主体流动对溶质的传递起主导作用；粘度：流体对流动的摩擦阻力，受温度和压力影响密度：显示物质内部分子之间的紧密程度9细胞培养工程南开大学对流：流体概念定义：在剪切力的作用下发生连续形变的物质分类物理状态气体液体可压缩性（密度）粘度牛顿非牛顿流体10Doran：BioprocessingEngineeringPrinciples细胞培养工程南开大学对流：流线概念定义沿着流路，并显示流速与相对位置关系的表示方法；线条的疏密程度表示流速的相对大小。恒定流速

低流速中有障碍物

发酵罐挡板区域层流湍流漩涡（Doran：BioprocessingEngineeringPrinciples）细胞培养工程南开大学对流：雷诺准数（Re）流体的流动状态，取决于流体的流速、粘度、密度、以及流路的几何形状；雷诺准数是用来描述流体的流动特点的参数（无物理单位）12圆形横截面管道

搅拌式发酵罐搅拌桨

D管径υ平均线性流速ρ

流体密度μ

流体粘度层流：小于2,100过渡：2,100-4,000湍流：4,000Ni搅拌桨转速Di

搅拌桨管径ρ

流体密度μ

流体粘度搅拌桨形状对液体流动状态影响很大，层流状态一般低于10细胞培养工程南开大学对流：边界层概念定义当流体与静止物体相接触时，受到影响的流体薄层被称作边界层；在静止物体表面，流速为零，称作静止层；由于流体粘度作用，边界层内部与静止层相邻的液层流速会降低（粘滞阻力）；离静止层越远，粘滞阻力越弱，流速越高，逐渐接近主体流速。因此，在边界层内部存在一个速度梯度。13意义：边界层的存在，不仅影响流体流动的性质，而且会影响各相之间传热和传质。（Doran：BioprocessingEngineeringPrinciples）细胞培养工程南开大学对流：粘度概念流体薄层内部同心圆柱体的转动能否带动外圆筒的转动？液体的性质：拉拽作用力的传导介质液体介质的作用面积直接影响作用力大小Brookfield粘度计工作原理14细胞培养工程南开大学对流：粘度（µ）将液体注入上下两块平板之间，距离D，面积为A当下板发生移动时，流体随其运动，但上板表面液体速度为零，因此形成速度梯度剪切力

F与速度梯度成正比154.剪切应力定义Doran：BioprocessingEngineeringPrinciples细胞培养工程南开大学粘度流体的流变学分类细胞培养工程南开大学对流：粘度的意义17Gases10－40.0010.1Water0.011.00.01Glycerol10110Blood0.031.20.025粘度（常温）

密度

运动粘度粘度是影响流体行为最重要的流体性质，相当于流体本身对流动所施加的摩擦阻力，损耗机械能粘度对流体的泵送、搅拌混合、传质、传热和液体通气，都有显著作用，因此，对于生物过程设计以及经济成本也有重要影响培养液的粘度受细胞、底物和空气影响。细胞培养工程南开大学5.搅拌式生物反应器

液体流动与混合18细胞培养工程南开大学搅拌式生物反应器内部基本结构19搅拌桨搅拌轴罐体细胞培养工程南开大学搅拌式生物反应器-搅拌桨主要类型MarinePitched-bladeTurbineRushtonTurbine轴向兼径向混合

径向混合

ElephantEar20细胞培养工程南开大学搅拌式生物反应器–径向混合流型RushtonTurbine21细胞培养工程南开大学微混合为主，兼有主体混合效果，氧传质效果较强高剪切力，适合微生物发酵高H/D反应器可配置多个搅拌桨搅拌式生物反应器–轴向混合流型22细胞培养工程南开大学轴向主体混合为主，搅拌温和大桨叶设计更适合大规模细胞培养搅拌式生物反应器–搅拌混合机理交换：湍流状态下，固态物质间发生相对运动剪切力：层流状态下，液层之间相对运动扩散：分子水平的交换。搅拌桨作用较大漩涡较小漩涡最小漩涡扩散作用Kolmogorovscale（cm）培养基运动粘性系数(cm2/s)单位质量流体能量耗散速率(cm2/s3)细胞培养工程南开大学cell搅拌式生物反应器–混合效果评估方法：在固定位点跟踪标示物浓度24细胞培养工程南开大学搅拌式生物反应器–混合效果评估Ci： 标示物初始浓度Cf

： 标示物最终浓度Tc

： 循环时间Tm： 混合时间，指达到所设定均匀度所需时间，

一般定义为

0.1(Cf-Ci)混合时间越短意味着混合效果越好25细胞培养工程南开大学6.搅拌式生物反应器

气-液传质26细胞培养工程南开大学引言细胞生长需要齐备的营养供给，限制性底物浓度对比生长速率（µ）的影响27细胞培养工程南开大学当其中一种底物浓度（Si）降低至制约细胞生长，成为限制性底物，Monod方程当溶解氧作为底物氧是细胞生长和代谢所必需底物之一氧在水溶液中的溶解度极低28细胞培养工程南开大学为了满足细胞的生理要求，反应器操作（主要是搅拌转速和通气流量）必须及时向培养体系提供氧气，避免耗尽氧的溶解度温度(oC)O2(mM)02.18101.70151.54201.38251.26301.16351.09401.03电解质（M)O2(mM)HClH2SO4NaCl0.01.261.261.260.51.211.211.071.01.161.120.892.01.121.020.71一个大气压下，温度对纯氧在水中溶解度的影响一个大气压下（25oC）,纯氧在不同浓度电解质溶液中的溶解度来源：Bailey&Ollis(1986),BiochemicalEngineeringFundamentals(2nded.),p46329细胞培养工程南开大学搅拌式生物反应器–通氧方式（2）顶部通氧（辅助）通氧效率较低，适合细胞浓度低的接种初期阶段不产生气泡（1）底部通氧（主要）通氧效率高产生气泡，需要采取保护措施（2）（1）细胞培养工程南开大学WAVEBioreactor-Cellbags细胞袋预先消毒，一次性使用，不必清洗通过支架的摇摆实现主体混合DO/CO2/pH控制0.1-500L细胞培养工程南开大学特殊细胞营养物质-溶解氧（DO）细胞生理代谢需要量最大的必需营养物质：

1C6H12O6+6O2

→6CO2+6H2O氧气以溶解氧（DO）形式在水溶液中存在，常温下溶解度非常低一个大气压空气（其中

O2占21%）37oC培养基溶液（盐类溶质的存在降低其溶解度）饱和浓度约为

0.21mM相较于葡萄糖浓度（如25mM），溶解氧不足以满足细胞生长需要，需要不断提供通氧（向反应器内部鼓气，或培养基顶部界面换气） (25-0)x6/(0.21-0)=714.3(倍)细胞膜对氧分子具有通透性，氧分子通过被动扩散进入细胞内部32细胞培养工程南开大学在不通氧的条件下，DO耗竭需要多久？假设条件：

活细胞密度为5x106(cells/mL)

细胞比需氧量为3.2x10-13(moles/cell/hour)

培养基为100%空气饱和（一般为50%左右），纯氧饱和溶解度为1.0mM。计算（以1000毫升计算）：1000毫升培养液中DO的总量为

(1.0mMx21%-0)=0.21(mmoles)=0.21x10-32.1000毫升培养液中总活细胞数量为 5x106(cells/mL)x1000(mL)=5x109(cells)3.活细胞每小时的需氧量（假设不随DO降低而变化） 5x109(cells)x3.2x10-13(moles/cell/hour)=1.6x10-3(moles/hour)

耗尽DO所需时间为 0.21x10-3(mles)/1.6x10-3(moles/hour)=0.13(hour)33细胞培养工程南开大学反应器通氧与搅拌Casea：通气量过高，搅拌速率过低，气泡围绕搅拌轴区域上升，搅拌桨起不到打散和分散气泡的作用（最低搅拌速率）；Casee：搅拌速率过高，上升气泡会再次回到主体，桨叶与气泡过多接触减少桨叶对液体的拉拽，降低液体主体的能量输入和混合（最高搅拌速率）。34细胞培养工程南开大学搅拌式生物反应器–搅拌器转向“PumpDown”-延长气泡停留时间×35细胞培养工程南开大学氧分子从气泡到细胞内传递步骤从气相主体扩散到气-液界面迁移并穿过气-液界面扩散并穿过第一个滞流层（最主要传质阻力），进入流体主体在主体流体中传递，进入第二个滞流层扩散并穿过第二个滞流层进入细胞内部参与生化反应（7）滞流层气泡细胞流体主体⑥⑤④③②①细胞膜⑦气-液传递37传递机制：成分A从气相进入液相，浓度梯度从气相到液相，由高到低气相CAGA在气相主体的浓度CAGiA在气-液界面的浓度kG

A的气相传递系数液相CALA在液相主体的浓度CALiA在气-液界面的浓度kLA的液相传递系数气-液传递38气相CAGA的气相主体浓度CAGiA的气液界面浓度kGA的气相传递系数液相CALA的液相主体浓度CALiA的气液界面浓度kLA的液相传递系数A的气相传递速率:a：气液相间界面总面积A的液相传递速率:气-液传递39气相CAGA的气相主体浓度CAGiA的气液界面浓度kGA的气相传递系数液相CALA的液相主体浓度CALiA的气液界面浓度kLA的液相传递系数a：气液相间界面总面积问题：难以准确测量！（1）气-液界面变量

CAGi/CALi/a（2）气、液相传递系数kG与

kL假设：（1）CAGi与CALi

的达到平衡（2）在CAGi浓度较低的情况下，CAGi与CALi

呈线性关系，m为分配因子气-液传递40细胞培养工程南开大学气-液传递41细胞培养工程南开大学体积传递系数

KLa传质系数（KL）氧传质阻力的倒数测定难度单位液体体积气-液界面面积（a）受通气量和搅拌速率影响测定难度体积传递系数

KLa可测定度量反应器氧传递能力，KLa值越高，系统氧传递能力越强，可支持更高细胞密度生长42细胞培养工程南开大学体积传递系数

KLa测定

-动态法将上式进行积分，得到43细胞培养工程南开大学为与气相氧浓度对应的液相饱和溶解氧浓度体积传递系数（KLa）测定-动态法通过向培养基液体中鼓氮气，使DO降低至一定水平关掉氮气并开始鼓空气，实时记录溶氧浓度44细胞培养工程南开大学体积传递系数（KLa）测定-动态法3.ln(C*-CL)对时间

t

作图，计算斜率–KLa（秒-1）45细胞培养工程南开大学7.搅拌式生物反应器中的

细胞损伤46细胞培养工程南开大学引言搅拌式生物反应器大规模细胞培养工业生产过程的主要工具培养过程研究与优化，对其它反应器类型具有指导意义细胞损伤生理损伤营养缺乏与代谢副产物累积与反应器型式关系不大，所有培养过程都有可能发生物理损伤动物细胞无细胞壁反应器中强制混合所产生的水力作用反应器通气供氧过程中的气泡作用47细胞培养工程南开大学主体流体中的细胞损伤主体流体的基本结构：流体环境：湍流能量发散模式：旋涡链：搅拌桨运动产生大旋涡桨叶宽度决定旋涡大小较大旋涡衍生较小旋涡直至形成最小旋涡能量转化：通过粘性耗散，动能转化成热。在旋涡形成链中，能量首先以从大旋涡到小旋涡的形式传递；最后在最小旋涡中，通过粘性耗散转化成热。48细胞培养工程南开大学主体流体中的细胞损伤Kolmogorov理论：Kolmogorov尺度(KolmogorovLengthScale,cm)培养基液体运动粘性系数(cm2/s)局部单位质量流体的能量耗散速率(cm2/s3)49细胞培养工程南开大学主体流体中的细胞损伤Kolmogorov理论诠释：Kolmogorov尺度对应最小湍流漩涡大小培养基运动粘性系数与其呈正相关关系搅拌桨能量输入与其呈负相关关系指导意义：与细胞或微载体尺度相当的旋涡是导致细胞损伤的主要因素之一；在实际操作中，当最小旋涡的直径小于微载体直径的1/2–2/3时对细胞的破坏效果最强；过程放大：几何结构相似反应器搅拌桨转速预测50细胞培养工程南开大学主体流体中的细胞损伤过程放大：几何结构相似反应器搅拌桨转速预测51细胞的比死亡速率（sec-1）系数搅拌桨转速（sec-1）微载体直径（m）反应器体积（m3）培养基液体运动粘性系数(cm2/s)细胞培养工程南开大学主体流体中的细胞损伤过程放大：几何结构相似反应器搅拌桨转速预测

体积增大到10倍，维持比死亡速率不变52细胞培养工程南开大学主体流体中的细胞损伤搅拌桨转速预测的经验法则：反应器几何结构相似反应器体积增大到10倍，为了维持细胞的比死亡速率不变，搅拌桨转速需要减低到原转速的60%左右;该法则虽然来自微载体培养过程，但对搅拌式细胞悬浮培养过程放大仍具有指导意义。

53细胞培养工程南开大学气泡相关的细胞损伤搅拌式生物反应器在大规模动物细胞培养中的使用最为普遍大多以气体直接鼓入来满足细胞对氧的需求；直接鼓泡供氧方式最简单有效；但是，鼓泡会导致细胞损伤。反应器顶部通气虽然效率较低，但在早期培养阶段（细胞密度较低）不失为上策；其它供氧方法在大规模培养中有放大技术问题，但可能会在其它特殊应用中发挥作用。54细胞培养工程南开大学气泡相关的细胞损伤反应器中的气泡行为：在鼓泡器（或分布器）上的生成和释放在液相主体中的上升在顶部空间破裂55细胞培养工程南开大学气泡相关的细胞损伤气泡在鼓泡器（或分布器）上的生成和释放观察：在相同气体体积流量下，改变分布器气孔气流速率，细胞比死亡速率没有明显变化；结论：气泡生成和释放不是细胞损伤主要原因。

气泡在液相主体中的上升观察：尚有