蛋白质异源表达及其稳定性的定向进化

蛋白质异源表达及其稳定性的定向进化

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内容蛋白质的定向进化1定向进化的方法2定向进化的筛选3蛋白质定向进化的应用前景422蛋白质的定向进化方法2体外随机引发重组error-pronePCR（易错PCR）DNAshuffling(DNA改组)332error-pronePCR（易错PCR）概念：利用PCR过程中出现的碱基错配对特定基因进行随机诱变的技术称为易错PCR（error-pronePCR）。原理:通过降低传统PCR中一种或者两种dATPdGTPdCTPdTTP的浓度并且加入一定量的MnCl2，同时采用低保真度的TaqDNA聚合酶。使基因在扩增时能随机的创造突变。遗传变化只发生在单一分子内部,故属于无性进化(asexualevolution)操作手段：

（１）降低氯化镁的浓度；

（２）是添加氯化锰

（３）是降低其中某一种单核苷酸的浓度或者

用核苷酸三磷酸盐类似物替代其中一种单核苷酸关键：选择适当的突变频率优点：快速、简便、操作方便缺点：它比较费力耗时,一般适用于较小的基因片段(<800bp）432error-pronePCR（易错PCR）error-prone

PCR532DNAshuffling(DNA改组)

DNA改组(DNAshuffling)又称有性PCR，是将一群密切相关的序列(如多种同源而有差异的基因或一组突变基因文库)在DNaseI的作用下随机酶切成小片段，这些小片段之间有部分的碱基序列重叠，它们通过自身引导PCR延伸，并重新组装成全长的基因。632DNAshuffling(DNA改组)

732基因家族之间的同源重组Familyshuffling

Familyshuffling指用DNAshuffling技术,改组进化上相关的一系列基因。当从自然界中存在的基因家族出发,利用它们之间的同源序列进行DNA改组。由于每一个天然酶的基因都经过千百万年的进化,并且基因之间存在比较显著的差异,所以获得的重组基因库充分体现了基因的多样化，又最大限度的排除了那些不需要的突变。832体外随机引发重组

体外随机引导重组是以单链DNA为模板，配合一套随机引物，产生互补于模板不同位置的短DNA片段库(由于碱基错配，这些短DNA片段也含有少量的点突变)，然后进行类似于DNAshuffling的全长基因装配反应，获得多样性文库。与DNAshuffling相比，体外随机引发重组具有以下优点：

a．用单链DNA为模板，对模板量要求少，大大降低了亲本组分，便利筛选；b．克服了DNAshuffling中片段重新组装前必须彻底去除DNaseI的缺点；c．片段组装体系与片段合成体系缓冲系统可兼容，组装前无需纯化操作；

d．随机引发DNA合成不受模板DNA长度的限制，便利了小肽的改造。932体外随机引发重组

1033定向进化的筛选

在定向进化中尽管突变体具有随机性，但通过选择特定方向的突变限定了进化趋势，加之控制实验条件限制突变种类降低突变率缩小突变库的容量，不仅减少了工作量更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。手段:高通量筛选体系和超高通量筛选体系建立。（对比以前的挑单菌落摇瓶复筛，筛选数目多，试剂少，信号灵敏，自动化程度较高）蛋白定向进化最核心的部分在于建库的多样性和筛选的高效性。

筛选过程首先是将突变基因进行分离并尽可能多地表达成蛋白质，其次是将蛋白质的活性通过亲和、催化或报告基因等方式表现为可检测的形式，最后是将符合要求的蛋白质分离出来。1133蛋白质定向进化的筛选

常用的筛选方法：利用底物显色反应改变培养条件(如逐步提高培养温度,或改变培养基的pH等)

利用某些蛋白的固有性质,如产生绿色荧光高通量筛选(HTS:HighThroughoutScreening),该技术可以根据待测样品的合成路线分为液相和固相筛选,也可以根据筛选目标物分为纯蛋白受体亲合性筛选,酶活性筛选,细胞活性筛选等。1233利用底物显色方法筛选

颜色变化是最简便的追踪酶反应的方法，如用对硝基苯基衍生物检测水解酶的活性。根据水解释放出的黄色对硝基苯酚或对硝基苯胺来进行检测。下图显色底物可检测葡萄糖苷酶。碱性条件显色pH8大多数酶并不能直接引起颜色变化，为了检测一个没有生色集团的底物的反应，需要将反应产物转变为一个有色化合物。1333改变培养条件进行筛选

根据细胞生长情况筛选突变基因：提高培养温度抗生素改变培养基的pH高渗透压低温有毒物及抑制剂

OD-MonitorOD值测定传感器

1431利用蛋白质的固有性质（荧光标记）

荧光检测法具有灵敏性高、方法简便的优点，在高通量筛选中被广泛应用，该方法可以使用很稀的底物浓度和极少量的催化剂进行检测。1533噬菌体展示筛选技术

噬菌体展示技术是将各种多肽或蛋