探讨有氧运动改善海马组织氧化应激水平的机制,运动生理学论文

探讨有氧运动改善海马组织氧化应激水平的机制,运动生理学论文近年来，老年人学习记忆能力减退相关疾病的发生率逐年上升，已引起了国内外的广泛关注。Floyd等研究发现，活性氧自由基(reactiveoxygenspecies，ROS)的增加与衰老的进程及老龄化经过中认知功能的退化密切相关。大量研究结果已经证实，长期适宜强度运动能够降低氧化应激相关疾病的危险性，且能够抵抗老龄化导致的认知功能减退，这一现象在人及动物模型中已经得到广泛验证。尽管有氧运动改善脑组织氧化应激水平进而改善认知功能的现象不断得到证实，但有氧运动改善脑组织氧化应激水平确实切机制仍然没有完全说明。过氧化物酶体增殖活化受体辅助活化因子1(Peroxisomeproliferator－activatedreceptorgammacoactivator1－alpha，PGC－1)是ROS新陈代谢的重要调解因子，而AMP激活蛋白激酶(AMP－acti-vatedproteinkinase，AMPK)则是调解PGC－1磷酸化的一种蛋白激酶，其表示出变化可对PGC－1表示出产生重要影响。在肌肉组织内，AMPK及PGC－1表示出的变化对改善肌肉组织氧化应激水平具有重要调控作用。但在脑组织内，有氧运动能否通过改善以上蛋白表示出而到达了改善氧化应激水平的目的，当前尚未见到相关报道。为此，研究对8周有氧运动老年大鼠海马ROS水平、抗氧化物酶活性(超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase，GPx))、脂质过氧化产物(丙二醛，malondialdehyde，MDA)、PGC－1及AMPK表示出水平进行了检测，旨在讨论有氧运动改善海马组织氧化应激水平的机制，进而为揭示有氧运动抵抗老龄人口认知功能减退的相关机制提供实验根据和数据支持。1材料与方式方法1．1实验动物及分组实验选用鼠龄为24月的健康雄性Wistar大鼠，体质量为(34020)g，常规分笼饲养，自由进食饮水，自然光照，动物房内温度(203)℃，相对湿度为40%～60%。动物随机分为空白对照组(CG)、运动组(EG)，每组8只，共16只。1．2大鼠有氧运动方案运动组大鼠先进行一周的适应性跑台训练(隔天1次，共3次)，速度10m/min，每次15min。适应性训练后，未见不良反响的大鼠于24h后进行正式实验。大鼠有氧运动方案采用修改后的Bedford递增负荷跑台运动方案。运动组大鼠共进行8周有氧跑台训练，每周5次，训练均布置在每周的周一至周五晚间进行，运动负荷如表1所示。1．3样本的制备最后一次运动24h后，用2%戊巴比妥钠(3mL/kg)腹腔麻醉大鼠，断头取脑，冰玻片上迅速剥离出两侧海马，－80℃冰箱保存待测。1．4ROS、SOD、GPx及MDA含量的测定采用化学荧光法对大鼠海马ROS含量进行测定。取大鼠海马0．1g，按质量(g)∶体积(mL)=1∶20的比例参加匀浆介质(100mmol/L磷酸缓冲液)，冰水浴条件下机械匀浆，1000g离心10min，取部分上清采用考马斯亮蓝法对其进行蛋白定量检测(A045－2试剂盒，南京建成)。另取匀浆上清液参加荧光探针(E004，南京建成)，37℃孵育30min，对其荧光强度进行测定(激发波长500nm，发射波长525nm)，测定结果以荧光强度/毫克蛋白表示。大鼠海马SOD、GPx及MDA的含量采用相应试剂盒进行检测(南京建成)，操作经过严格根据试剂盒讲明书进行。【表1】1．5PGC－1及AMPK的测定大鼠海马PGC－1及AMPK的测定采用west-ernblot方式方法进行，实验经过如下:取适量海马匀浆处理后参加裂解液(包含137mMNacl，20mMTris－HClpH8．0，2%NonidetP－40，10%甘油及蛋白酶抑制因子)，将其超声处理30s后，4℃环境下15300g离心15min，收集上清，采用BCA蛋白定量方式方法测定总蛋白浓度，分装，于－80℃保存待测。取20g蛋白进行SDS－PAGE凝胶电脉(8～12%，V/V)，PVDF膜转印，5%脱脂奶粉封闭(室温，2h)。参加经过TBS－T缓冲液稀释的一抗(PGC－1，1∶1000，货号13067，SantaCruzBiotechnology，美国;AMPK，1∶2000，货号2532，CellSignalingTechnolo-gy，美国)，4℃过夜后，将膜放入TBS－T缓冲液进行冲洗，参加HRP标记二抗，室温孵育1h，TBS－T缓冲液中反复冲洗之后，与加强化学发光剂孵育。在暗室中使用X胶片曝光，显影，定影后观察结果。使用Quantityone(Bio－Rad)软件对目的蛋白和内参蛋白进行光密度分析，以actin蛋白为内参。目的蛋白相对含量=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。1．6统计学处理所得数据均用平均数标准差(xs)表示，利用SPSS10．0对所有数据进行处理并进行独立样本T检验，P＜0．05表示差异显着。2研究结果2．1不同组别大鼠海马ROS含量的比拟如此图1所示，8周有氧运动训练使大鼠海马ROS含量较对照组显着降低(P＜0．05，相对浓度分别为0．690．03和0．390．02)，提示有氧运动训练可显着减少海马活性氧自由基水平。【图1】2．2不同组别大鼠海马SOD及GPx活性的比拟实验结果发现(见图2－A及图2－B)，运动训练组大鼠海马SOD及GPx活性较对照组均显着上升(P＜0．05)，运动组与对照组SOD活性分别为(88．077．46)U/mgprot及(105．0315．17)U/mgprot;GPx活性分别为(2．830．42)U/mgprot及(4．370．73)U/mgprot)。【图2】2．3不同组别大鼠海马MDA含量的比拟实验结果发现(见图3)，对照组大鼠海马MDA含量为(3．090．41)U/mgprot，而运动训练组含量为(1．510．34)U/mgprot，两组间呈现差异显着(P＜0．05)，提示长期有氧运动训练可显着降低海马脂质过氧化损伤水平。【图3】2．4不同组别大鼠海马PGC－1表示出的比拟如此图4所示，对照组海马PGC－1表示出水平为0．640．19，与对照组相比，运动组海马PGC－1表示出显着升高(1．180．29，P＜0．05)。【图4】2．5不同组别大鼠海马AMPK表示出的比拟实验结果显示(见图5)，运动组海马AMPK含量为2．10．37，与对照组相比(1．640．29)显着升高(P＜0．05)。提示有氧运动训练可显着增加海马AMPK表示出水平。3分析与讨论海马是与认知功能高度相关的脑区之一，研究对8周有氧运动训练后大鼠海马氧化应激水平进行了观察，发现运动组大鼠海马ROS含量及反响脂质过氧化水平的MDA含量显着降低(P＜0．05，见图1、图3)，而反映脑组织抗氧化水平的SOD、GPx活性显着升高(P＜0．05，见图2)。已经知道体内ROS去除的第一道防线是由抗氧化剂的酶促作用组成的，首先在SOD的作用下，ROS转化为过氧化氢，过氧化氢再在GPx和/或过氧化氢酶的作用下被去除，由于脑内过氧化氢酶的含量非常低，因而，脑组织中过氧化氢的去除主要依靠GPx来完成。随着年龄的增长，第一道防线的抗氧化能力逐步降低，又由于老龄化经过中，海马对氧化损伤的敏感性增加，因而，老龄化经过中海马极易遭到氧化损伤，只能通过降低神经容量来维持氧化复原的内环境稳态，神经容量的减少影响到学习记忆的能力，继而导致认知功能的损害。而长期有氧运动训练后，随着SOD、GPx活性的升高，其抗氧化能力得到加强，氧化应激相关疾病的危险性降低，继而使老龄化导致的认知功能减退得以缓解，这一途径可能是运动训练预防老龄化经过中认知功能减退的重要机制之一。以往研究证实，不同的运动强度对不同组织氧化复原状态的调节幅度不同。Radak等研究发现:一次力竭运动和重复力竭运动会增加肌肉和肝脏中ROS的含量和氧化损伤，而适宜强度的规律性运动则会降低大鼠脑内氧化应激水平，这一结果提示，运动训练经过中训练的强度和训练量是关键，否则不仅不会起到有益作用，反而会适得其反，加重老龄化经过中认知功能障碍等神经系统退行性疾病的程度。【图5】长期有氧运动训练可改善大鼠海马氧化应激水平，这一现象在以往研究中已经有少量报道。本研究除进一步证实该经过外，还对运动训练改善其氧化应激水平的深层机制进行了初步探寻求索。PGC－1是神经细胞氧化复原平衡的调节因子，是诱导SOD－1、SOD－2和GPx等抗氧化酶基因表示出的必要因素，PGC－1表示出的上调能够缓解神经元由于氧化应激介导的细胞死亡，在防止神经变性经过中发挥作用。因而，PGC－1被以为是调解ROS新陈代谢重要调解因子之一。除此之外，PGC－1还可作用于与调控线粒体电子传递活动有关的转录因子，影响线粒体的功能，进而影响能量代谢。Koltai等研究结果显示，运动训练能够提高老年大鼠肌肉PGC－1的蛋白表示出。Steiner等研究结果显示，8周运动训练可导致特定脑区PGC－1mRNA表示出的上调。然而，有关长期有氧运动对老年大鼠海马PGC－1表示出影响的研究至今尚未见到相关报道。本研究结果发现，长时间有氧运动能够提高老年大鼠海马中PGC－1蛋白表示出的水平，该途径可能是导致海马SOD、GPx活性上升，ROS、MDA含量下降，进而使海马氧化应激水平得以改善的机制之一。AMPK作为调解PGC－1磷酸化的一种蛋白激酶，其表示出变化可对PGC－1表示出产生重要影响。Yu等研究发现，药物刺激AMPK能够促进视觉皮层神经元PGC－1的转录激活。Jager等研究结果显示，骨骼肌AMPK的激活可介导PGC－1的表示出。因而，讨论长期有氧运动对大鼠海马AMPK表示出的影响对于理解PGC－1及下游SOD、GPx活性变化具有重要意义。本研究结果显示，长时间有氧运动使大鼠海马AMPK蛋白表示出增加。笔者揣测，运动对AMPK表示出变化的影响可能是通过钙调节蛋白依靠性激酶(Calmodulin－dependentkinase，CaMKK)及氧化复原状态变化介导的。已经知道CaMKK是调节AMPK表示出变化的上游调节因子之一，Hescham等研究报道，运动可导致CaMKK的变化，继而可能介导AMPK表示出的上调。除此之外，运动经过中产生的ROS及运动造成的脑组织适度缺氧也会诱导CaMK