有关物质方法建立与验证

有关物质检查方法学建立以下内容适用于有较强的紫外吸收、用常规反相色谱法可良好分离的被测物的纯度检查。以常用的C18和C8柱为例。1、溶解度考察考察被测物在水、甲醇、乙腈、冰醋酸、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷等几种常用溶剂中的溶解度，判断被测物极性强弱。2、紫外光谱绘制考察被测物在水、甲醇、乙腈等常用溶剂中的紫外吸收情况，一般选取最大吸收波长作为流动相选择时的检测波长。几种被测物最大吸收波长不一致时，选取共同吸收较大的波长。3、流动相的选择中性成分被测物为中性成分时，一般选择甲醇-水、乙腈-水、四氢呋喃-水三种系统。乙腈-水系统由于粘度小，通常可以得到良好的柱效。此外，乙腈的紫外末端吸收比甲醇小，在低波长处检测基线波动小，测定误差小。被测物为极性较大的中性成分时，系统中甲醇或乙腈的比例可适当小些。被测物为极性较小的中性成分时，可适当增大甲醇或乙腈的比例。碱性成分向流动相中加入胺类扫尾剂。常用三乙胺、二乙胺、乙二胺、正丁胺等。加入反离子，常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠及十二烷基磺酸钠。高碳数离子对试剂使保留时间过长，可更换低碳数的离子对试剂。流动相的pH一般为3〜5。酸性成分向流动相中加入少量弱酸，常用甲酸、醋酸。适用于分离3勺莎7的弱酸。加入反离子，常用的离子对试剂为四丁基季胺盐及四丁基磷酸盐等。流动相的pH一般为7〜7.5。4、流动相的要求被测物之间分离良好，分离度达到1.5以上。主成分保留时间以10分钟为宜。分析时间通常为主成分保留时间的2~3倍。分析时间过长的可考虑采用剃度洗脱。5、检测波长的再确定以选定的流动相为溶剂，考察被测物的紫外吸收情况。有DAD检测器的，考察主成分峰纯度，应达到98%以上。综合以上考察结果，将检测波长作修正。6、供试品溶液浓度的选择配制一系列不同浓度的溶液，在不过载的前提下确定浓度的增加不再引起杂质增加的拐点浓度。配制已知原料、中间体、杂质等的稀溶液，确定其检测限与定量限。通常以0.1%计，反推得供试品溶液的最低浓度。综合以上考察结果，以柱效最优作考量，确定供试品溶液的浓度。7、方法学验证准确度对于有定量要求的杂质要通过回收率试验验证方法的准确度。例如某杂质的限度为0.2%，可分别配制该杂质浓度为0.1％、0.2％和0.3％的杂质溶液各三份，分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率，并计算9个回收率数据的相对标准差（RSD）。各浓度下的平均回收率均应在80%-120%之间，如杂质的浓度为定量限，则该浓度下的平均回收率可放宽至70%-130%，相对标准差应不大于10%。线性适用与有定量要求的杂质检查。在定量限至一定的浓度范围内配制6份浓度不同的供试液，分别测定该杂质峰的面积，计算相应的含量。以含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。可接受的标准为：回归线的相关系数（R）不得小于0.990,Y轴截距应在100%响应值的25%以内，响应因子的相对标准差应不大于10%。精密度适用与有定量要求的杂质检查。重复性配制6份杂质浓度（一般为0.1%）相同的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得6份供试液含量的相对标准差应不大于15%。中间精密度配制6份杂质浓度（一般为0.1%）相同的供试品溶液，分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得12个含量数据的相对标准差应不大于20%。专属性空白对照应无干扰，主成分峰或需定量的杂质峰与其它峰应能完全分离，分离度不得小于2.0。强制降解试验考察主成分在酸、碱、高温、强光、氧化等因素影响下的稳定性。对固体状态的被测物而言，一般还需分别考察在固体和溶液状态下的稳定性。要求降解产物与主成分或需定量的杂质峰完全分离。酸降解试验一般选择0.1N的盐酸，在室温或加热条件下进行考察。碱降解试验一般选择0.1N的氢氧化钠溶液，在室温或加热条件下进行考察。高温降解试验分别在固体和溶液状态下进行考察，可分别在60、80°C考察30天，或在130C考察8小时。光降解试验分别在固体和溶液状态下进行考察，例如，可先经一百二十万勒克斯（Lx）X小时的冷白荧光灯照射，再经200瓦小时/平方米的紫外荧光灯照射。氧化降解试验主要在溶液状态下进行考察，氧化剂可采用不同浓度的双氧水，分别在室温或加热条件下进行考察。同时须进行双氧水的空白试验。检测限与定量限杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于3。杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于10。另外，配制6份最低定量限浓度的溶液，所测6份溶液杂质峰保留时间的相对标准差应不大于2.0%，峰面积的相对标准差应不大于5.0%。耐用性分别考察流动相比例变化±5%、流动相pH值变化土0.2、柱温变化土5C、检测波长变化±5nm、流速相对值变化土20%以及采用三根不同批号的色谱柱进行测定时，仪器色谱行为的变化，每个条件下各测试两次。可接受的标准为：各杂质峰的拖尾因子不得大于2.0，杂质峰与其他成分峰必须达到基线分离；各条件下的杂质含量数据（n=6）的相对标准差应不大于2.0%，杂质含量的绝对值在±0.1％以内。系统适应性适用与有定量要求的杂质检查。配制6份相同浓度的杂质溶液进行分析，该杂质峰峰面积的相对标准差应不大于2.0%，保留时间的相对标准差应不大于1.0%。另外，杂质峰的拖尾因子不得大于2.0，理论塔板数应符合质量标准的规定。溶液稳定性按照分析方法分别配置对照品溶液与供试品溶液，平行测定两次主成分与杂质的含量，然后将上述溶液分别贮存在室温与冰箱冷藏室（4