腐烂苹果中的细菌分离以及理化性质的检测

腐烂苹果中的细菌分离以及理化性质的检测摘要：从腐烂苹果中取样培养细菌，用平板直线划线法分离纯化细菌，经扩大培养后进行镜检和革兰氏染色实验，最后对分离出的纯种细菌进行理化性质检测：细菌水解淀粉实验以及探究pH对细菌生长的影响实验。实验结果显示，腐烂苹果中的细菌形状小而圆，是革兰氏阳性菌；水解淀粉实验说明该细菌中没有水解淀粉的酶；分光光度法所得的数据显示该细菌的生长环境偏中碱性。关键词：腐烂苹果、细菌、平板直线划线法、革兰氏染色、水解淀粉、分光光度法StudytheBacteriaofRottenApplesintheSeparationandPhysical&ChemicalPropertiesLinjia-wan(Collegeoflifescience,SouthChinaNormalUniversity,Guangzhou510631,China)Abstract:Sampletrainingbacteriafromtherottenapples,andpurifybacteriawithflatlinearcrossedmethod;Afterexpandingthebacteria,theyaretestedbyMicroscopicexaminationandGramstaining,andfinally,testphysicalandchemicalpropertiesoftheisolatedpurebacteriawithBacteriahydrolysisstarchexperimentandexploringthepHofthegrowthofthebacteriainfluenceexperiment.Theexperimentalresultsshowthatthebacteriainrottenapplesaresmall,roundinshape,andaregram-positive;Theexperimentofthebacteriahydrolysisstarchindicatedthatthosebacteriadon’thaveenzymethatcanhydrolyzeamylum;Spectrophotometryincomedatasshowedthatthosebacterialiketogrowintheenvironmentofalkalineslant.Keywords:rottenapples;bacteria;Flatlinearcrossedmethod;Gramfaerbung;hydrolyzeamylum;Spectrophotometry引言：现今，市场的水果摊位仍会出售腐烂的水果，而有些人不清楚腐烂水果会滋生很多细菌，即使把腐烂的部分挖去，细菌也会蔓延到其它部分。例如苹果只要烂了一个小洞，其3厘米厚的果肉都已相应变质。食用后，轻则容易引起肠道不适、腹泻呕吐等，重则会患上痢疾或肠胃炎，甚至可能造成脱水休克。因此，检测腐烂水果中腐烂果肉以及完好果肉的细菌性质的实验具有重要意义。1材料与方法1.1材料以及试剂腐烂苹果2个、牛肉膏、蛋白胨、无菌水、结晶紫、碘液、95%乙醇、番红、NaCl、可溶性淀粉、琼脂、卢戈氏碘液、1mol/LHCL以及1mol/LNaCl(用于调节pH)1.2实验用具接种铲、接种环、超净工作台、平板培养皿、试管、酒精灯、酒精棉球、硅胶塞、显微镜、擦镜纸、载玻片、盖玻片、吸水纸、小滴管、牛皮纸、报纸、火柴、吹风筒、三角瓶、pH计、分光光度计、恒温摇床、手提式灭菌锅、移液枪、托盘天平1.3实验方法平板直线划线法、镜检法、革兰氏染色法、分光光度法2染色以及理化性质实验原理2.1细菌的革兰氏染色实验原理先将细菌标本用结晶紫染色，再加媒染剂碘液（增加染料和细菌细胞的亲和力），使它和结晶紫在菌体细胞中形成分子量较大的紫碘复合物，然后用酒精进行脱色，最后用复染剂复红染色。假使细菌细胞不被脱色而保留初染紫颜色者，称为革兰氏阳性菌；若被脱色，而染上复染剂的红颜色者，称为革兰氏阴性菌。通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经复红复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。2.2细菌水解淀粉实验原理某些细菌可以产生水解淀粉的淀粉酶，它能把淀粉水解为糊精、麦芽糖、葡萄糖，再被细菌所利用。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色、产生透明圈。菌体培养后，平板上加上卢戈氏碘液，在淀粉发生水解的地方，淀粉-碘复合物的蓝色特征就会消失。淀粉的水解发生在离开菌落的一段距离，这是因为产生的胞外淀粉酶渗入到周围的培养基中所致。若无透明圈，表明该细菌无淀粉酶。2.3pH影响细菌生长实验的原理不同微生物对pH条件的要求各不相同，它们只能在一定的pH范围内生长，可分为生长最低pH，生长最适pH，生长最高pH。细菌一般在pH4-9范围内生长，生长最适pH一般为6.5-7.5；在实验条件下，人们常将培养基pH调至接近中性，而微生物在生长过程中常由于糖的酵解产酸或蛋白质降解产碱而使环境的pH发生变化，从而影响微生物的生长。3实验步骤3.1配制培养基3.1.1配制牛肉膏蛋白胨固体培养基按比例称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂，将以上药品溶解于水中，待药品完全溶解后再补充水分至500ml。用pH试纸检测培养基的pH，直至达到pH7-7.6，将配制好的培养基分装于三角瓶中，放在灭菌锅中121℃灭菌30分钟。将灭菌的培养基倒平板和倒斜面，做好标记放在冰箱中保存。配制牛肉膏蛋白胨液体培养基按比例称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl，将以上三样药品溶解于水中，待药品完全溶解后再补充水分至150ml。用pH试纸检测培养基的pH，直至达到pH7-7.6，把其中的100ml的培养基倒入5个三角瓶,调节pH分别为3,5,7,9,11，用作细菌悬液，把剩下的培养基分别装在5支试管中（用于pH对细菌生长影响实验的空白对照），调节pH分别为3,5,7,9,11,做好标记封口，放进高压灭菌锅121灭菌30min，待用。3．1.3配制淀粉培养基称取牛肉膏，蛋白胨，NaCl，可溶性淀粉，琼脂，并溶解在沸水中，倒入三角瓶，封口，放进高压灭菌锅112℃灭菌30min。灭菌后在无菌条件倒平板，待用。3.2取样培养在超净工作台上用酒精擦拭腐烂苹果的表皮，然后用接种铲挖取腐烂果肉以及完好的果肉，分别接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，做好标签标记，放在37℃培养箱中培养24小时。3.3分离纯化上述细菌经24小时后长出细菌，在超净工作台上用接种环挑取该细菌，然后用平板直线划线法在牛肉膏蛋白胨划线，进行分离纯化，做好标记并放在37℃恒温培养箱培养24小时。划线分离纯化后得到纯种单个细菌菌落。3.4镜检在载玻片上滴一滴无菌水，用无菌操作方法从培养皿单菌落中挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜；将涂片用吹风筒吹干；将载片通过微火2-3次固定；将涂片置于水平位置，滴加染液覆盖于涂菌处，染色2分钟；用自来水的细水流由载片上端流下，冲去染液；干燥水分之后用低倍镜和高倍镜观察细菌的形态和大小，确定该菌落是否是单菌落。3.5保种把分离纯化得到的单个菌落接在斜面培养基上，放在冰箱存放待用。3.6革兰氏染色用无菌操作方法从试管斜面中沾取菌液1环，用接种环在洁净的载玻片上涂一薄而均匀的菌膜，涂菌后将接种环在火焰上灭菌；用吹风筒吹干；将细菌涂片膜向上，通过火焰3次来固定细菌于玻片上；用结晶紫初染涂片1分钟；水洗稍干之后，加入碘液媒染1分钟；水洗稍干之后，用95%乙醇脱色5-20秒；水洗稍干之后，用复红复染1分钟。3.7细菌水解淀粉酶实验在超净工作台上，以无菌操作技术，把菌种接种在淀粉培养基上，可划成“+”字形，培养基的一边接一个种。在培养基底部做好记号，盖上盖，倒置于37℃下培养24小时；将平皿盖打开，滴入适量卢戈氏碘液于接种处，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满平板。3.8pH对细菌生长的影响实验在超净工作台内，将纯种菌接到之前做好的装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶里，将已接种的5个三角瓶置于37℃、200r/min震荡培养48小时；将上述三角瓶取出，在分光光度计（600nm）上分别测定培养物的OD值，记录好结果。4实验结果4.1腐烂苹果中的腐烂果肉以及完好果肉都含有细菌、霉菌实验结果显示，腐烂果肉一定含有细菌和真菌，而完好果肉中可能有细菌和真菌。果肉培养1天后，长出细菌，3-5天之后长出了白色霉菌，细菌2-3天之后死亡。图一左为腐烂苹果A中的腐烂果肉，右为腐烂苹果A中的完好果肉图一说明该腐烂苹果的腐烂部分含有细菌，而该完好部分不含细菌。图二左为腐烂苹果B中的完好果肉，右为腐烂苹果B中的腐烂果肉图二表明该腐烂苹果完好部分的细菌疯狂地长满整个培养基，说明完好的果肉也有细菌，腐烂果肉反而不长细菌。图三腐烂苹果B中的腐烂果肉图三显示虽然腐烂苹果B中的腐烂果肉不长细菌，但3-4天之后，长出了白色的霉菌。4.2细菌的单个菌落特征以及革兰氏染色特征图四平板直线划线分离单菌落图四划线材料是腐烂苹果A腐烂果肉中的细菌，肉眼可见分离纯化出了单个菌落。分离纯化得到的单个菌落湿润，正反面颜色一致，呈白色，菌落小而微隆起，菌落与配养基结合不紧密，有臭味。图五细菌的革兰氏染色图五显示，通过革兰氏染色，在显微镜下观察该细菌呈紫色，是革兰氏阳性菌，细胞小而圆。图六保存单个菌落于试管中4.3细菌无水解淀粉的酶图七细菌水解淀粉实验图图七在细菌水解淀粉的测定中，滴加卢戈氏碘液的后观察到菌苔周围没有出现透明圈，表明该细菌不含水解淀粉的酶。4.4不同pH对细菌的影响不同经分光光度法的测定，得到不同pH下液体培养基的OD值不同，列表如下：pH值357911OD600表一细菌不同pH的OD600图八细菌不同pH的生长曲线5分析与讨论5.1腐烂苹果中的腐烂果肉以及完好果肉都含有细菌、霉菌综合腐烂苹果A和B的实验现象得：完好果肉也含有细菌。只要水果发生霉变腐烂，各种微生物特别是各种真菌都会在腐烂水果中不断加快繁殖，并在繁殖过程中产生大量有毒物质。这些有毒物质又不断从腐烂部分，通过水果汁液向未腐烂部分渗透、扩散，导致未腐烂部分同样含有微生物的代谢物。腐烂苹果B的腐烂部分不长细菌的原因可能是在用酒精擦拭苹果表面时把细菌杀死，但2-3天后长出了霉菌，表示酒精没有杀死霉菌。无论是腐烂果肉还是完好的果肉都有细菌、真菌，所以，腐烂的水果不能吃。5.2平板直线划线法不能分离出单菌落原因：在划线前，培养基放在冰箱中冷藏，划线后，在室温下的培养基的盖皿液化形成许多小水珠，水珠掉落到划线处，造成划线失败。解决方法：重新配培养基，倒平板冷却后不放冰箱冷藏，直接划线接种。5.3分离出的细菌是革兰氏阳性菌镜检和革兰氏染色的图片看不清单个细菌。原因一是挑取镜检的细菌较多，二是该细菌非常小。该细菌有臭味这一特性，跟腐烂的水果有臭味是相吻合。分理出的细菌是革兰氏阳性菌，阳性菌的磷壁酸抗原性很强，是该菌的重要表面抗原；某些革兰氏阳性菌细胞壁表面还有一些特殊的表面蛋白，如a蛋白等。所以吃腐烂水果对人体有害。5.4不同