第5章 蛋白质翻译

第五章

蛋白质翻译

5.1.基本概念5.2.基本元件5.3.GeneticCode5.4.peptidesynthesize5.5.保证peptide准确翻译的机制5.1.基本概念●thesecondstepofgeneexpression●tRNAasaadapter(转接器)forcodon&aminoacid●tRNAloadingaabyaa-tRNAaa合成酶(氨酰tRNA合成酶，AARS)●tRNArecognitioncodonbyanti-codon（反密码子）●codon：universaltriplexcodon三联体密码子twoofthreereadingcodon三中读二codonincodon广义密码子●codondegeneracy：wobblehypothesis摇摆假说isoacceptor同工受体●codonusage(codonbias)密码子的利用（偏爱）●mechanismofexactlytranslationinitiation,loading,elongation,proofreading5.2.基本元件5.1.1.tRNA●miniRNA,4S,(74-94Nt)●tRNAphe,77Ntcloverleafform(1964HollyR.)●4arms&4loops●Ntmoremodifiedbymethylation---aa接受臂;

loadingaaat3’end---DHUloop;

contactwithAARS---anti-codonloop;

---TΨCloop;

contactwith5srRNA---extraloop;分类标准34tRNACys表示转运半胱氨酸的tRNACys-tRNACys表示携带了半胱氨酸的tRNACys●tRNA的”L”三维结构与功能“L”构型的结构力---二级结构中双链区的碱基堆积力和氢键---二级结构中非双链区在“L”结构中，形成氢键结合---“L”结构中碱基堆积力大使其拓扑结构趋于稳定---wobblebase（摇摆碱基）位于“L”结构末端堆积力小自由度大使碱基配对摇摆---TΨCloop&DHUloop位于“L”两臂的交界处，利于“L”结构的稳定“L”结构域的功能---aaacceptarm位于“L”的一端，契合于核糖体的肽基

转移酶结合位点PA,以利肽键的形成---anti-codonloop位于”L”另一端，与结合在核糖体小亚基上的codonofmRNA配对APaa’-tRNAaahaveGCcontentof60%&Richmethylation

eachcellcontainsfromseveralhundredtoover20,000copiesofrDNAgenerRNAsynthesizedinnucleolusRibosomalgenes(rDNA)aredifferentinseveralwaysfromothernucleargene5.2.2.rRNA●Prokaryote23S,16S,5S/Eukaryote28S-5.8S,18S,5S●Richmethylation(m2U,m3A,m3U,m26A(二甲基)…)细菌核糖体70S真核生物核糖体80S●InProk.3’-endof16SrRNA富含CCU保守序列互补mRNA5’端的前导序列SD序列富含(AGG)●5srRNA与TΨCloopoftRNA部分同源，并可配对InEuk.3’-endof18srRNA与原核生物高度相似,但无与S.D.seq.互补的保守序列AMEAMECCUGCGGUUGGAUGACCUCCUUAMEAMECCUGCGGAAGGAUGAUUA16S细菌18SrRNA哺乳动物高度相似●23srRNA---6domains---有的与对抗生素的抗性有关---2660±Ntregionα-Iloop(alphaSarcin)bindingwithcomplexofaa-tRNAaa~(EF)-Tu~GTP(引起核糖体变构！！)G2661

C,aa-tRNAaaintoAsitegodown---G2252,G2253双突变为C,将对转肽酶的活性产生抑制mRNA具有两个必需的特征：

可翻译的密码序列（开放阅读框架，ORF）核糖体结合位点（RBS）5.2.3.mRNA●InProkaryote5’-end;300±Ntleadingseq.(A/G-------------AUG)S.Dseq---------------------AUGpoly-cistron9NtbetterrichA,U,Shine-Dalgarnoseq.(S.D):富含嘌呤→Gmut.translationgodown●InEukaryotemono-cistron5’

m7Gppp--------CCACC-----A/G-3---A1U2G3G4—leadingseq.核糖体小亚基扫描AUG的信号序列至关准确翻译起始Kozak序列ButmRNAofchloroplastshowssimilaritiestoprokaryote.

5.3.GeneticCode5.3.1.

Universaltripletcodoncodon的特征●codon是mRNA上连续排列的三个核苷酸序列，并编码一个氨基酸信息的遗传单位●codon具有通用性与保守性（除mt）●

在一个基因序列中codon具有5’→3’方向编码、不重叠性和无标点性MarshallNirenberg(1961)ButInvitroPoly(U)poly(Phe)peptidePoly(C)poly(Pro)peptidePoly(A)poly(Lys)peptidePoly(G)poly(Gly)peptidepoly(UCUCUC…)poly(Ser-Leu-Ser-Leu…)

UCU/CUC

Ser/Leu?密码子的破译(1968.nobelprize)M.Nirenberg&P.Leder(1964.Science145;1399)InvitrotRNAaaRibosomeNitrocellulosefilterUCU(tri-nucleotide)Ser-C14,Leu,Lys,Arg,…Ser,Leu-C14,Lys,Arg,…Ser,Leu,Lys-C14,Arg,………Ser-C14….

Leu-C14….

Lys-C14….

Gly-C14….

61个codons被破译，仅剩UAA,UAG,UGA

(Stopcodon).Geneticcodon字典5.3.2.Degeneracyofcodon(密码子的简并现象)a)简并现象的概念；---一种氨基酸有2个或2个以上codon编码的遗传现象---编码一种aa的4个codon间,仅3rdNt不同,称为codonfamily例；Ser(6codons)1codonfamily&2extracodonsCGU,CGC,CGA,CGG,AGA,AGG密码子的简并性b)简并现象的机理；●

IsoacceptortRNA;负载同一氨基酸，但识别不同密码子的tRNA●Wobblehypothesis;

反密码子:密码子1th-Nt:3rd-NtmRNA5’---CGU---CGC---CGA---CGG---AGA---AGG---3’GCGGCUUCU3’5’3’5’3’5’AAAwobbletRNA3isoacceptors1codonfamily2extracodons在一定范围内的可选择配对现象●

Wobblebase的摇摆配对原则13由于变偶性的存在，细胞内只需要32种tRNA就可以识别61个编码氨基酸的密码子。●Wobblebase摇摆配对的机理---tRNA的拓扑空间结构34th摇摆位点位于拓扑结构的末端，碱基堆积力小，选择性配对的自由度大---34th摇摆位点被修饰的频率高选择配对的关系发生变化---34th几乎无A---线粒体中U34=NwhenUU*=A/Gonly尤以A34

I

I=A/I=C/I=U5.3.3.codonusage(codonbias)

tRNA拷贝数与codon使用频率对应---识别同一氨基酸的不同tRNA(isoacceptor)量不等---不同生物间同一isoacceptor的量不等tRNAabundance与codonusage(codonbias)协调性是进化中形成的基因表达调控机制之一生物GC%不等各种codon的频率不等进化过程CodonusageObservedforE.coliRibosomeProtein1209codonsCodonusageinthegenesofAnimals2244codons（1）codonusage~正相关~tRNAabundance需要量多的蛋白质（除mRNA转录速率高外）需要量少的蛋白质（除mRNA转录速率低外）有关aa的codonusage高相应tRNA量多关键aa的codonusage低相应tRNA量少进化中形成的蛋白质翻译调控机制（modulator）23/1209>10/120913/1209>3/1209Phe(UUC)>(UUU)Tyr(UAC)>(UAU)Anti-codonAAG1AUG1（2）codon与anti-codon间的作用强度codonusage5.3.4.遗传密码的变异性a)线粒体中具有与通用密码不同的编码信息●

线粒体codon较为整齐（均为2/4/6）●Inmt22tRNAonly(32tRNAinuniversalcode)

线粒体“三中读二”方式可减少tRNACodonsComparingbetweeninusualandinmt●Codon-reading“三中读二”方式（密码子家族中）codonUCU-----UCA-----UCG-----UCCanti-codonAGUUC

SercodonN3rd(U)A/U/C/G

仅起将codon隔开的作用●Codon-reading其余的密码子由tRNA识别第三位为A、G或U、C的密码子。

wobblebaseG

C/UwobblebaseU*

G/A5.3.5codonincodonorgeneralgeneticcodon(广义密码)生物体除具有标准的通用密码保证蛋白质的准确翻译外同时存在codonincodon减少有害突变生物的适应性2edNtofcodon对氨基酸的编码特征即为GGCorcodonincodona)codon/anti-codon间的缔合能分析●2edNtofcodon（N1N2N3）对codon/anti-codon的缔合能贡献最大凡2edNt相同的codoncodon/anti-codon间的缔合能相似●对缔合能的贡献

2Nt＞

1thNt＞

3rdNtb)codon对氨基酸性质的决定2edNtofcodon对氨基酸性质和蛋白质空间结构的决定度较大NUN非极性、疏水和支链的氨基酸α-helix&β-sheet的形成者位于蛋白质分子内部NA/GN极性、亲水性氨基酸,位于蛋白质分子外部NCN非极性、不带电荷的极性侧链Codonincodon(依2edNtofcodon预测氨基酸的性质)GGN疏UGU/C疏GGNMW75kdCUNUUU/CGCN小AUA/CAUA/CUCNGUNGUNCCNGCUCUNGUNUUU/CAUGCANUGU/GUGGUGU/CAUGCAU/CCUNACN中UAG/C中AUA/C中N1N2N3N1N2N3N1N2N3不同方法测定aa的亲水性和分子量结果

(1)(2)F.J.R.Taylor1989Bio-Systems22.p177-187UCN中GCN中GAU/C中UGGGGNAAU/CUAU/CACNGAA/GCAA/GUCNCAA/GAAA/GCCNAAA/GAAU/CCGNAUGGAA/GAAU/CCAU/CCAU/GCAA/GUUU/CGAU/C亲GAA/GCGNCGNGAU/C亲UAU/CAAA/GUGG大204kd2edNt=U(hydrophobicaa)A/G(hydrophilicaa)C(neutralaaorhydrophobicaa)c)Ntofcodon对蛋白质功能的决定●1th&3rdNt的摇摆对蛋白质的结构与功能影响不大●2edNt不能摇摆d)生物学意义依据codonincodon（2edNtofcodon）判断氨基酸的性质保证遗传的稳定蛋白质性质预测蛋白质定点诱变蛋白质改造（蛋白质工程）5.4.peptidesynthesizeProteinsynthesisoccursinthreesubcellularcompartmentseachcontaindifferentmachineryinplantMorethan20,000proteins50-10030-405.4.1.DirectionofpeptideelongationN’C’

R1OHR2

R3H

O

H

ON—C—C—N—C—C

+

N—C—CH

OH

H

OHHHHR3

R1OHR2H

O

H

ON—C—C

+

N—C—C—N—C—CH

OH

H

OHHHH机制？HCNHHCHHSCH3COPOH3ACCA-O2ACCAPO3-OH2Met+tRNAfmetOH2’OH3’转酯aa甲酰化HCNHHCHSCH3COHHCO甲酰甲硫氨酰-tRNA合成酶inProk.

f

Met—tRNAf

met

&

Met--tRNAmmet5.4.2.Aminoacyl—tRNAaainEuk.Met—tRNAImet

&

Met--tRNAemet5.4.3.peptidesynthesizeAARSAminoacyltRNAsynthetase氨基酰tRNA合成酶氨基酸活化氨基酰tRNA合成氨基酰-AMPa,氨基酸活化b.InitiationfactoroftranslationinProk.IF-19.5kd加强IF-2，IF-3的酶活IF-295kd-117kd促使fMet-tRNAfmet选择性的结合在30S亚基上IF-320kd促使30S亚基结合于mRNA起始部位具有解离30S与50S亚基的活性核糖体小亚基是起始复合物的装配位点InitiationoftranslationinProk.IF-2fmetfmet30s-mRNAcomplexBinarycomplexGTPCompleteInitiationcomplexfmetfmetIF3IF3InitiationoftranslationinEuk.eIF-2GTPMetMetSubunitInitiationComplexSubunitbindingtoendofmRNAMetMetATPADP+Picomplexc.InitiationEnzyme0ftranslationinEuk.eIF-23种亚基形成三元起始复合体（eIF-2,GTP,tRNA)eIF-2A65kd促使Met-tRNAmet与40S亚基结合ieIF-115kd促使mRNA与40S亚基结合eIF-3＞500kd促使mRNA与40S亚基结合eIF-4B80kd促使mRNA与40S亚基结合eIF-4A50kd促使与mRNA,GTP结合eIF-4C19kd促使两亚基结合eIF-5150kd释放eIF-2,eIF-3eIF-4E(eIF-4F的亚基)与5‘端帽子结合d.ribosome主要功能位点Psite(肽酰基结合位点，peptidylattachmentsite)Asite(氨酰基结合位点，Aminoacylbindingsite)Esite(退出位点，ExitsiteoftRNA)CompleteinitiationComplexoftranslationTranslationdomainExitdomainmembraneExitsite5ssitePeptidyltransferasePsiteAsiteEF-GsiteEF-TusitemRNAsite20NtfMetMetfMet-tRNAmetfMet-tRNAmetid.Processinginitiation?S.D.Sequence?ScanningsequencePACInitiationCCPAfMetMetAElongation三个步骤：进位，肽键形成，移位延伸因子（elongationfactor）：EF-Tu,EF-Ts,EF-GElongationPAMetAUGAPMetAUGUUUCUGUAGPheTs+ADPATPTuTsGDPTuGTPPhePAAUGUUUCUGUAGMetPheMetPheTsTuGTPTuGDPEF-GbeneededfortranslocationTemperateS多肽的终止(Terminationofpeptide)---When终止密码子进入核糖体Asite释放因子1或2识别tRNA+mRNA+large&smallsubunit…核糖体解体肽酰转移酶转变成酯酶活性，水解RF-1识别UAA、UAG；RF-2识别UAA、UGA；RF-3释放肽链核糖体释放因子，RRF蛋白质释放因子，RFTerminationM

F

LPAAUGUUUCUGUAGMFLPAUUUCUGUAGTFMFLPAUUUCUGUAGMFLTF---stopcodonusage（统计学上的规律）---UAAstopcodon终止效率高UAG易被漏读E.coli

165genesBacillus

52genesYeast

105genes对codonbias强的基因多选用UAA

对codonbias弱的基因多选用UGA该基因多选用2或3个stopcodonProteinsysthensisconclusion氨基酸与tRNA专一性结合核糖体沿mRNA移动方向：5’→3’肽链延伸方向：N端→C端GTP作为能量5.4.4翻译的跳跃现象

--------GGA-----UAG-----UCC-----50NtUAGAUGCGCStem-loopIRIR5.4.5真核、原核细胞蛋白质生物合成比较5.5.保证peptide准确翻译的机制DNAreplicationξ=10-11RNAtranscriptionξ=10-4PeptidetranslationP(准确率)=（1—ξ）n(氨基酸的数目)

NP(ξ=10-2)P(ξ=10-3)P(ξ=10-4)100