基因工程复习提纲

1.1DNA重组技术的基本工具一、 基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创诰出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。概念分析①基因工程技术的原理：基因重组②目的:创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。③操作水平：DNA分子水平 ④操作环境：体外优点：克服远缘杂交不亲和障碍，定向改造生物性状女从结构上分析，为什么不同生物的DNA能够重组？（1）DNA的基本组成单位都是四种脱氧核昔酸。（2）双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构C了外源基因在受体内表达的理论基础（1）基因是控制生物性状的独立遗传单位。 （2）遗传信息的传递都遵循中心法则。（3）生物界共用一套遗传密码。二、 基础理论和技术的发展催生了基因工程（一） 基础理论的重大突破DNA是遗传物质的证明1944年，艾弗里等人通过不同类型肺炎双球菌的转化实验，不仅证明了生物的遗传物质是DNA，还证明了DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体，艾弗里等人的工作可以说是基因工程的先导。DNA双螺旋结构和中心法则的确立1953年，沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型。1958年，梅赛尔松和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。中心法则阐明了遗传信息流动的方向。遗传密码的破译人们认识到，自然界中从微生物到人类共用一套遗传密码，而且为基因的分离和合成等提供了理论依据。（二） 技术发明使基因工程的实施成为可能基因转移载体的发现1967年，罗思和赫林斯基发现细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移，这一发现为基因转移找到了一种运载工具工具酶的发现科学家发现了多种限制醯、连接醯、逆转录酶，这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。DNA合成和测序技术的发明 ④DNA体外重组的实现重组DNA表达实验的成功1973年，博耶和科恩选用仅含单一EcoRI酶切位点的载体质粒pSC101，使之与非洲爪蟾核糖体蛋白基因的DNA片段重组。重组的DNA转入大肠杆菌DNA中，转录出相应的mRNA，这个实验证明了：质粒不仅可以作为基因工程的载体，重组DNA还可以进入受体细胞，外源基因可以在原核细胞中成功表达，并实现物种之间的基因交流。第一例转基因动物问世科学家通过显微注射技术培育出世界上第一个转基因小鼠，科学家用农杆菌转化法，培育出世界上第一例转基因烟草。PCR技术的发明三、★★★★★基因工程的基本工具“分子手术刀”一一限制性核酸内切酶(限制酶)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。迄今已从近300种不同的微生物中分离出了约4000种限制酶。思考：为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？细菌中限制醯之所以不切断自身DNA,是因为微生物在长期的进化过程中，形成了一套完善的防御机制，生物在长期演化过程中，含有某种限制醯的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制醯的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开，这样尽管细菌中含有某种限制醯，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核昔酸之间的磷酸二酯键断开。结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。黏性末端:当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。平末端：当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。TTAAAATT1CCC:G(；G C(X' G(；GSwwl : —►(XX^：CCC UGG CCC(黠性未瞄) (Witt末辱)中崎些 平末腐“分子缝合针”——DNA连接酶作用：将双链DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核昔酸之间的磷酸二酯键。种类：两种DNA连接酶：E•coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶E•coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接：T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，T〈DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核昔酸加到已有的核昔酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。HOC 口DkKC。DNA连接酶DNA聚合酶不同点连接的DNA双链单链模板不要模板需要模板连接的对象2个DNA片段单个脱氧核苷酸加到已存在的单链DNA片段上相同点作用实质形成磷酸二酯键化学本质蛋白质3.“分子运输车”一一基因进入受体细胞的载体（1） 载体具备的条件：对受体细胞无害，能在受体细胞中复制并稳定保存。具有一个或多个限制醯切点，供外源DNA片段插入其中。具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。能在受体细胞中自我复制或整合到染色体DNA上随染色体DNA进行同步复制（2） 最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小双链环状DNA分子。（3） 其它载体：久噬菌体的衍生物、动植物病毒（4） 在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。（5） 天然的DNA分子可以直接用做基因工程的载体吗？为什么？不可以，基因表达载体需要有启动子、终止子、标记基因等部分组成，天然的DNA分子不能满足人们的需求，需要进行人工改造才能使用。1.2基因工程的基本操作程序基因工程的四个步骤：①目的基因的获取、②基因表达载体的构建（核心）、③将目的基因导入受体细胞、④目的基因的检测与鉴定一、第一步：目的基因的获取目的基因可以从中分离出来，也可以用的方法合成。目的基因主要指编码蛋白质的基因（与生物抗逆性相关的基因、与优良品质相关的基因、与毒物降解有关的基因），也可以是一些具有调控作用的因子。2、 获取目的基因的方法：从基因文库中获取，利用PCR技术扩增，化学方法人工合成。基因文库概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。包括基因组文库（包含一种生物全部基因）和部分基因文库（只包含了一种生物的一部分基因如cDNA文库）思考：为什么要构成基因文库？直接从含目的基因的生物体内提取不行吗？构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。4、 **★★★基因组文库和cDNA文库的构建方法将某种生物体内的 全部出来，选出适当的，将DNA切成一定范围大小的DNA片段，然后将这些DNA片段分别与连接起来，导入 的群体中储存，每个受体菌都含有了一段不同的DNA片段，这个群体包含了这种生物的 ，叫做如果用某种生物的mRNA产生的多种（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么这个受体菌群体就叫做这种生物的cDNA文库。5.★★★★★PCR技术扩增目的基因（1） PCR技术的含义：多聚醯链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。它以极少量的DNA为模板，在几小时内复制I出上百万份的DNA拷贝。（2） 优点：短时间内扩增大量的目的基因（3） 原理：DNA双链复制（4） 前提：有一段已知目的基因的核昔酸序列，以便根据这一序列合成引物（5） 过程：（在PCR扩增仪中完成）第一步：变性：加热至90〜95°CDNA受热变性解链为单链：第二步：复性：冷却到55〜60C，引物与两条单链相应互补序列结合：第三步：延伸：加热至70〜75C，热稳定DNA聚合酶（Taq酶）从引物起始进行互补链的合成。如此重复循环总结：扩增过程：变性一复性一延伸一循环。上述过程可以在PCR扩增仪中自动完成（6） 结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即呈指数形式扩增。（约2n其中n为扩增循环的次数）注意：DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。（7） 反应条件：DNA模板（上有目的基因）、引物（两种）、Taq酶和4种脱氧核昔酸（dNTP）、缓冲液，另外还要控制温度3。日仪：自动调控温度的仪器）。DNA复制需要引物的原因：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从3’端延伸DNA链。DNA的合成方向：从子链的5’端到3’端。【例】如图为dATP（d表示脱氧）的结构示意图，dATP水解后能参与DNA的合成.欲使新合成的DNA分子被32P标记，下列说法正确的是（ ）a.应用32p标记位置in处的磷酸基团dATP在DNA合成时既能作为原料，也能提供能量 1 11了dATP中的“T指的是dATP含有3个高能磷酸键dATP中含有高能磷酸键，是主要的能源物质

注意：DNA体内复制过程中解旋需要解旋酶催化，而PCR过程中，DNA是在高温处理下变性解旋，PCR过程中所需的DNA聚合酶是耐高温的DNA聚合酶称为热稳定DNA聚合酶（Taq酶），是从热泉中某种嗜热菌中提取出来的。DNA体内复制的结果是形成完整的DNA分子，而体外DNA复制的结果是合成大量的DNA片段。6、人工合成法：①条件：基因比较小，核苷酸序列又已知。②方法：通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。二、第二步：基因表达载体的构建（核心）基因表达载体的构建目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因等（1） 启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。（2） 终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。是终止转录的信号。（3） 标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素抗性基因。【思考】：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么答：不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：①生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达：②通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；③目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；④为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；⑤有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。基因表达载体的模式图三、第三步：将目的基因导入受体细胞基因表达载体的模式图转化的概念:是目的基因讲入是体细胞内，并且.在受体细胞内维持稳定和表达的过程。常用的转化方法：将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。3、**★★★农杆菌转化法农杆菌能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力含日的翎的 宙篱组「担救的霞杆•貌肆因的UNAT-DSA将度的用跋旅人染色体的BNA中原理：植物受损伤，伤口姓细胞分泌大量酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移DNA）可转移至是体细胞，并且整合到是体细胞染色体DNA上。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进

入植物细胞，并将其插入到植物细胞中染色体含日的翎的 宙篱组「担救的霞杆•貌肆因的UNAT-DSA将度的用跋旅人染色体的BNA中【思考】：根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从理论上说，你应该如何做？农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些酚类物质吸引农杆菌向受伤组织集中。这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这是单子叶植物不易被农杆菌侵染的原因。近年来还发现一些中性糖，如L-阿拉伯糖、D-木糖等也有诱导作用。酚类物质和糖类物质既可以作为农杆菌的趋化物，又可以作为农杆菌中Ti质粒上Vir区（毒性区）基因的诱导物，使Vir区基因活化，导致T-DNA的加工和转移，从而侵染植物细胞。利用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时，是需要加上述酚类物质的。如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；②要加趋化和诱导的物质，且的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。4、基因枪法：又称微弹轰击法，是利用压缩的气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入中，使目的基因与其整合并表达的方法，常用的金属颗粒有 和粒子，这是 植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高。是我国科学家独创的一种方法，植物受粉后，花粉形成的 还未愈合前，剪去，然后滴加DNA，使目的基因借助进入受体细胞。简便经济。5、将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。受体细胞多是受精卵。用到的仪器:注意：要想把转基因的动物受精卵培育成动物个体，还需结合胚胎工程中早期胚胎培养和胚胎移植等技术相结合，6、将目的基因导入微生物细胞：方法：钙离子处理法原核生物特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，最常用的原核细胞是大肠杆菌，其转化方法是：先用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，就表明目的基促进感受态细胞吸收DNA促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。四、第四步：目的基因的检测与鉴定首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键，方法是采用DNA分子杂交（DNA-DNA）技术。（要注意谁和谁杂交，谁是探针）将转基因生物的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素作标记，以此为探针，使探检测对象方法子平分水目的基因是否导入DNA分子杂交法目的基因是否转录DNA-RNA分子杂交法目的基因是否翻译抗原一抗体杂交法体平受体是否具有转基因特征接种实验因已插入染色体DNA中。探针：带放射性同位素标记的目的基因单链。其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，这是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步，方法是采用分子杂交（DNA-RNA）技术。从转基因生物中提取的mRNA与放射性同位素标记的目的基因探针杂交，如果显示杂交带，表明目的基因转录出了mRNA。最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用抗原一抗体杂交技术。注意从转基因生物中提取的是蛋白质，用相应的抗体与其杂交，若杂交带出现，表明目的基因已形成蛋白质产品。有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如抗虫抗病接种实验、转基因产品的功能活性检测（需要与天然产品功能活性比较）。【思考】：利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？蛋白质上的糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。【跟踪训练】科研人员以抗四环素基因为标记基因，通过基因工程的方法让大肠杆菌生产鼠的6-珠蛋白，治疗鼠的镰刀型细胞贫血症.下列相关实验设计不合理的是（ ）从小鼠DNA分子上克隆出6-珠蛋白基因的编码序列用编码序列加调控序列、抗四环素基因等元件来构建基因表达载体用Ca2处理大肠杆菌后，将基因表达载体导入具有四环素抗性的大肠杆菌中用含有四环素的培养基筛选出已经导入6-珠蛋白编码序列的大肠杆菌1.3基因工程的应用1、 植物基因工程技术主要用于哪些方面？2、 抗虫基因有哪些？3、 抗虫棉的目的基因是什么？目的基因从何而来?对哺乳动物有害吗？4、 将抗虫基因导入植物细胞中用的最多的方法是什么？我国的科学家将抗虫基因导入棉花用了什么独创的方法？5、 细菌的基因之所以能“嫁接”到棉花细胞内，原因是？组成细菌和棉花的DNA分子的空间结构和化学组成相同6、 利用基因工程培育抗虫棉，与诱变育种和杂交育种相比，有什么优点？是属于哪种变异？7、 什么是病原微生物？有哪些种类？8、 在抗病转基因植物中使用最多的是什么基因？在抗真菌转基因植物中使用什么基因？9、 盐碱和干旱对农作物的危害与什么有关？在抗盐碱和抗干旱作物中使用了什么基因？10、转基因矮牵牛的目的基因是什么？ 11、动物基因工程有哪几方面的应用？12、 提高动物生长速度用什么基因？13、 ★什么是乳腺（房）生物反应器？科学家将 基因与等调控组件重组在一起，通过 等方法，导入哺乳动物的中，然后将受精卵送入母体内，使其生长发育成转基因动物。转基因动物进入泌乳期后，可以通过分泌的乳汁来生产所需要的药品。

14、什么是工程菌？ 15、基因工程药品包括？16、 ★基因治疗概念？分类： 17、 基因芯片的应用？1.4蛋白质工程的崛起1、 蛋白质工程崛起的缘由基