固定化酶的生产

酶的固定化技术摘要：固定化酶(ImmobilizedEnzyme)是20世纪60年代发展起来的一项新技术。它是通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体，或将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用。这么好的酶是如何生产的以及它的应用前景是怎样的，本篇文章就对这些问题进行一些论述。关键字：固定化、束缚、生物技术、固定化细胞Abstract：ImmobilizedEnzymewasanewtechnologyofdevelopingfromsixtyyearsoftwentycentury.Itdependsonphysicalorchemicalmeanstoboundenzymesoncarrierswhicharenotdissolvedintowaterorinacertainspace.Itcanlimitthefreeflowofenzymesmolecule,butthecatalysiscanbecomeintoplayfully.So,thispassagewilldiscusshowtoproducesuchagoodenzymeandwhatistheappliedinfuture.Keywords：Immobilized,bounded,biotechnology,Immoilizedcell前言：固定化酶是指经过一定改造后被限制在一定的空间内，能模拟体内酶的作用方式，并可反复连续地进行有效催化反应的酶。固定化酶又称固相酶。在理论研究上，固定化酶可以作为探讨酶在体内作用的模型;在实际使用中，可使生产工艺自动化和连续化，提高酶的使用效率。、酶的固定化方法酶的固定化方法总体分为：可溶性酶的方法和不溶性酶的方法。酶的固定化方法可溶性酶的方法 ] [ 不溶性酶的方法:包描〕 〔*] [无衍生作用][衍生作用I I X, JL (、<--xF1 ■ T- 3凝胶包微胶纤维载体交埋包埋k, 包埋结合X _ ■/业物理离子螯合或金属共价〔吸附〔结合）k离子结合’1■结合J卜面将重点介绍可溶性酶的方法1、结合法：1.1载体结合法将酶结合到非水溶性的载体上。一般来讲,载体的亲水性基团越多，表面积越大，单位载体结合的酶量也越大。最常用的是共价结合法，此外还有离子结合法、物理吸附法。1.1.1共价结合法是将酶蛋白分子上官能团和载体上的反应基团通过化学价键形成不可逆的连接的方法。在温和的条件下能偶联的酶蛋白基团包括有氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等。常用的载体包括天然高分子（纤维素、琼脂糖、葡萄糖凝胶、胶原及其衍生物），合成高分子（聚酰胺、聚丙烯酰胺、乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物等）和无机支持物（多孔玻璃、金属氧化物等）。共价结合法制备的固定化酶酶和载体的连接键结合牢固，使用寿命长，但制备过程中酶直接参与化学反应，常常引起酶蛋白质的结构发生变化，导致酶活力的下降，往往需要严格控制操作条件才能获得活力较高的固定化酶。1.1.2离子结合法通过离子效应将酶固定到具有离子交换基团的非水溶性载体上的一种方法。能引起离子结合的载体，除具有离子交换基团的多糖类外,象离子交换树脂那样的合成高分子衍生物也可用作载体。离子结合法与共价结合法比较，操作简便，处理条件温和，可以得到较多高活性的固定化酶。但载体和酶的结合力不够牢固，易受缓冲液种类和pH的影响。最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等；其他离子交换剂还有各种合成的树脂如AmberliteXE-97、DoweX-501.1.3物理吸附法将酶吸附到不溶于水的载体上而使酶固定化的方法。常使用的载体有活性炭、氧化铝、高岭土、硅胶、多孔玻璃、羟基磷灰石等。物理吸附法操作简便、费用较省,可供选择的载体类型多,有的可以再生。但酶与载体的相互作用较弱，被吸附的酶容易从载体上脱落，酶的非专一性吸附会引起酶的部分或全部失去。影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素：PH：影响载体和酶的电荷变化，从而影响酶吸附。离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越强。多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。1.1.4螯合或金属结合法这是一种相当新的技术采用过渡金属化合物作为活化载体表面的手段，这样可通过螯合物形成将酶等物质直接偶联，而不必预先制备活化的载体衍生物。适用的载体有玻璃、几丁质、硅藻土、藻酸、明胶、聚（4和5-丙烯基氨基水杨酸）和纤维素。它们已用于固定酶和抗生素。1.2交联法利用双官能团或多官能团试剂与酶之间发生分子交联来把酶固定化的方法。常用的试剂有戊二醛、亚乙基二异氰酸酯、双重氮联苯胺和乙烯-马来酸酐共聚物等。参与此反应的酶蛋白中的官能团有N末端的a-氨基、赖氨酸的£-氨基、酪氨酸的酚基和半胱氨酸的巯基等。交联法反应比较激烈，固定化酶的活力，在多数情况下都较脆弱。共价交联法的四种形式：1.2.1酶直接交联法在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖于酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。操作简单，但是缺乏选择性，活力回收往往不高。1.2.2酶辅助蛋白交联当可得到的酶量有限，可以使用第二个“载体”蛋白来增加蛋白质浓度，从而使酶与惰性蛋白共交联的方法。这种“载体”蛋白即辅助蛋白，可以是白蛋白、明胶、血红蛋白等。1.2.3吸附交联法此法先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联，用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。1.2.4载体交联法用多功能试剂的一部分功能基团化学修饰高聚物载体，而其中的另一部分功能基团偶联酶蛋白。2、包埋法：将酶包裹于凝胶网格或聚合物的半透膜微中，使酶固定化。所用的凝胶有琼脂、海藻酸盐以及聚丙烯酰胺凝胶等；用于制备微囊的材料有聚酰胺、聚脲、聚酯等。将酶包埋在聚合物内是一种反应条件温和，很少改变酶蛋白结构的固定化方法，此法对大多数酶、粗酶制剂、甚至完整的微生物细胞都适用。但此法较适合于小分子底物和产物的反应，因为在凝胶网格和微囊中存在有分子扩散效应。加大凝胶网格，有利于分子扩散，但使凝胶的机械强度降低。2.1凝胶包埋法将酶分子包埋在高聚物网格内的包埋方法。聚丙烯酰胺包埋是最常用的包埋法，先把丙烯酰胺单体、交联剂和悬浮在缓冲溶液中的酶混合，然后加入聚合催化系统使之开始聚合，结果就在酶分子周围形成交联的高聚物网络。它的机械强度高，并可以改进酶脱落的情况，在包埋的同时使酶共价偶联到高聚物上，可以减少酶的脱落。海藻酸钠也可以用来作为包埋载体，它从海藻中提取出来，可被多价离子Ca2+、Al3+凝胶化，操作简单经济。K-角叉莱胶（卡拉胶）冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。包埋条件温和无毒性，机械强度好。固定化的酶活回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好。胶原和明胶也是常用的包埋载体。还有聚乙烯醇包埋法。2.2微囊化包埋法微囊法主要将酶封装在胶囊、脂质体和中空纤维中。胶囊和脂质体主要用于医学治疗，中空纤维主要适于工业使用。界面沉淀法是一种简单的物理微囊化法，它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。界面聚合法是用化学手段制备微囊的方法。所得的微囊外观好，但不稳定，有些酶还会因在包埋过程中发生化学反应而失。2.3纤维包埋Dinelli和他的同事发展了将酶包埋在合成纤维微孔穴中的固定化方法。先将酶分子包埋在纤维中，然后适用类似于纺织工业用的设备和制造人造纤维的传统湿纺技术连续生产。这种方法在几个方面均优于凝胶包埋法。由于使用很细的纤维可获得能结合酶的表面积大，纤维能抗弱酸、弱碱、高离子强度和某些有机溶剂，选用合适的聚合物，还显示出良好的抗微生物作用的能力，同时可固定一种以上的酶，适用于生产固定化的多酶系统。卜面是固定化酶制备方法的特点比较:特征父联物理吸附离子结合螯合或金属结合共价结合包埋制备中等简单简单简单难难结合力强弱中等中等强中等酶活性低中等高高高低载体再生不能可能可能可能极少用不能固定化成本中等低低中等高中等稳定性高低中等中等高高应用性无有有有无有保户酶作用可能无无无无有二、固定化酶的应用酶经过固定化后，比较能耐受温度及pH值的变化，可制成机械性能好的颗粒装成酶柱用于连续生产（或在反应器中进行批式搅拌反应），也可以制成酶膜、酶管等多种形式的酶反应器。随着固定化酶技术的发展，许多工业生物反应过程已相继问世。固定化酶作为现代生物技术的一个新的领域，发展很快。目前在工业上应用的数量并不多，这是因为在多数情况下酶的价格昂贵，一般酶活力的回收率不高，辅酶的再生较困难。所以，固定化酶作为生物催化剂主要用于生产精细的特殊化学品、药品，在食品工业中由于生物催化剂较化学催化剂安全，也将得到广泛使用。同时，固定化酶用于各种疾病的诊断、治疗及人工脏器；用作化学分析的酶电极；固定化酶用作燃料电池；固定化酶用作亲和层析手段，分离和提纯酶的底物、辅酶、抑制剂及抗体等，显示出广阔的前景。固定化酶技术应用的一个未来领域，或许是需要多相环境和（或）辅因子再生的多酶固定化体系的新反应器开发。目前适于工业应用的这种反应器还没有出现。这些应用包括用固定化酶和辅因子系统生产现在用发酵法得到的材料，以及合成新的有用的产品；用固定化酶技术处理食品制造工业的废水和排出物。由于能源成本提高，希望能有代用能源，人们预料通过化学能转换用太阳光发电的生物化学燃料电池将会发展。三、展望近年来，固定化酶技术的重要进展之一，是开发活微生物细胞的固定化。这一发展可以给固定化酶所固有的许多经济问题找到解决办法，例如，可避免开相当量酶的分离、提取、和纯化，并能最大限度减少酶的损失。因为它们能过增殖，因此可作为一种固定化酶的自动自我更新的形式。细胞的固定化意味着不必预先提纯酶就可以在非常相似于酶存在的天然环境条件下使用，而且包含了所有的必需辅因子等。总而言之，固定化酶的研究必趋向于固定化细胞，而固定化细胞必会成为一种重要的生物技术，给人类带来更多的奥秘。参考文献：徐凤彩.酶工程.