第三篇 实验动物的操作方法

第三篇实验动物的操作方法实验动物是当代生命科学研究的重要组成部分，从巴甫洛夫的条件反射发现到通过电刺激大脑揭示动物应答系统的中枢定位理论建立；以及当前生物医学领域建立的各种动物病理模型等等无不体现了实验动物的重要性。在生命科学、人类医药和健康研究，实验动物在生命活动中的生理和病理过程，与人类或异种动物都有很多相似之处，并可互相参照，一种动物的生活过程可以成为另一种动物或者人类的参照物。对一些难以在人身上进行的工作，及一些数量很少的珍稀动物，或一些因体形庞大、不易实施操作的动物种类，采用取材容易、操作简便的另一种动物来代替人类或原来的目标动物进行实验研究，这就是动物实验。为了保证这些动物实验更科学、准确和重复性好，可以用各种方法把一些需要研究的生理或病理活动相对稳定地显现在标准化的实验动物身上，供实验研究之用。这些标准化的实验动物就称之为模式动物。无论是从事生命科学研究还是从事环境生物科学研究者，只有对常用的实验动物的生物学特征、来源、主要用途以及实验操作方法有了基本了解，才能正确地选择与使用动物，才能获得可靠的实验结。尤其是随着现代生物医学的不断深入和发展，不仅对实验动物的种类和质量制定了严格的标准化管理和相应的法制条例，而且对实验动物的使用人也提出了同样严格的操作要求和行为准则。所谓的实验动物(experimemtalanimals)，一般是指“所有脱离自然环境而用于教学、研究和试验的动物”。但目前不同分支学科的教科书或操作手册中对实验动物的划定有很大差异，有的局限于哺乳动物的啮齿类、猫、犬和灵长类动物；有的则扩展到鱼类、两栖类、爬行类和鸟类。本教材则将实验动物定义范围扩展列低等的无脊椎动物(只要它们的来源或遗传背景清楚并已脱离野生环境)，这是基于下述2个理由：(1)生命科学(及环境科学、食品科学)研究所使用的动物并不局限于哺乳动物。(2)国际上已有许多发达国家的科学界和政府部门制定的“实验动物管理条例”中往往强调“科学研究尽可能使用低等动物(如原生动物、蚯蚓、昆虫等)而不用高等动物”。知道了实验动物的定义及其在生命科学的教学科研中的重要与必需，那么作为生命科学院的学生则有必要在理解优化动物、人道地对待动物和有效研究的基础上，学习和掌握实验动物的基本操作方法。实验动物的基本知识第一节实验动物的分类实验动物按遗传学控制分类近交系（InbredStrain）近交系的基本概念理论上把近交程度相当于连续全同胞兄妹交配20代以上，近交系数达98.6%以上，群体基因达到高度纯合和稳定的动物全体称之为近交系。近交（inbreeding）是指任何血缘关系相近的个体间进行的配偶，属于基因型分离交配。它能使动物群的基因纯合而达到稳定。在实验动物的遗传培育过程中，常见的近交方式有：全同胞兄妹（BXSmating），父女或母子交配（回交backcross），堂兄妹交配（cousinmating）等。近交系动物的特点及应用基因位点纯合性（homozygosity）遗传组成的同源性（isogenicity）长期遗传稳定性（stability）均一性（uniformity）遗传特征的可辨别性（identifiability）遗传组成的独特性（individuality）国际分布性（internationaldistribution）背景资料的完整性(backgrounddata)封闭群（ClosedColony）封闭群动物的基本概念通常把5年以上不从外部引种，只在群体内进行随机交配，为日常提供实验动物而进行生产的群体称之为封闭群。封闭群是一个长期与外界鼓励，雌雄个体之间能够随机交配的动物群。封闭群的关键在于不从外部引进任何新的基因，同时亦不让群内基因因近交而丢失，以保持封闭群一般遗传性和杂合性。封闭群动物的特点及应用封闭群动物具有杂合性，避免了近交衰退的出现，具有较强的繁殖力和生活力；封闭群动物的遗传组成具有很高度的杂合性；就整体而言，其遗传特性以及其他反应性能保持相对稳定，但就群体内个体而言，因其具有杂合性，所以个体间的反应性具有差异。常用的封闭群动物常用的封闭群动物主要有：昆明小鼠，NIH小鼠，ICR小鼠，LACA小鼠，Wistar大鼠，SD（Sprague-Dawley）大鼠，DunkinHarleg豚鼠，青紫兰兔，新西兰兔等。突变系（MutantStrain）突变动物的基本概念由于遗传物质的变化而使亲代与子代在某个形状上发生的变化称为遗传变异，这种变异一般可以通过生殖过程而传递给后代。而具有了突变型基因的动物称为突变动物,这些突变动物按照生物医学实验的要求,进行定向培育,育成的具有突变基因的近交系称为突变系(MutantStrain)。突变系动物的特点及应用遗传变异具有不定向性，对突变系动物的研究可以用来认识生命的复杂性，解释一些基本的生命现象。突变系动物作为人类疾病的动物模型而在基础医学和临床医学中应用。例如糖尿病小鼠，4号染色体基因发生隐形突变（db），纯合子小鼠肥胖，并伴有糖尿病，可作为糖尿病模型用于实验。常用的突变系动物糖尿病小鼠； 肥胖症大鼠（fa），第5号染色体隐性突变，纯合子动物肥胖，饮食亢进，血清中胰岛素含量高。系统杂交动物（HybridAnimal）系统杂交动物的基本概念两个不同近交系杂交所产生的第一代动物称系统杂交动物或F1动物（Firstfilialgeneration）。系统杂交动物的特点及应用杂交优势遗传和表型上的一致性具有杂合的遗传组成转基因动物（TransgenicAnimal）转基因动物是指以实验方法导入的外源基因在其染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的动物。嵌合体动物（Chimeras）嵌合体动物是指将动物早期胚胎进行分后与同种或异种的胚胎细胞聚合而发育成的个体。嵌合体动物体内带有两种遗传组成不同的细胞，从遗传组成特征来说，是自然界前所未有的类型。广泛应用于基因表达、细胞分化、胚胎发育、免疫功能、遗传病等研究领域。实验动物按微生物控制分类微生物控制是实验动物质量控制的一项重要内容。在开放条件下饲养，未经微生物控制的动物，体表和体内存在着大量的，种类繁多的微生物和寄生虫，这给实验结果造成不良影响。另外，一些人兽共患的病原体可以在人和动物之间交叉感染，对动物管理人员和实验者的健康构成威胁，因此，对实验动物进行微生物控制有着极为重要的意义。根据实验动物所携带其他生命体的情况，目前国际上一般将实验动物分为四个等级，即：无菌动物（germfreeanimal,GF）,悉生动物（gnotobioticanimal,GN,无特定病原体动物（specificpathogenfreeanimal,SPF）和普通动物（conventionalanimal,CV）。并对每个等级动物的微生物控制程度和饲养环境条件进行以下规定：表1按微生物控制程度的分类原则种类饲养条件控制程度无菌动物（GF）隔离系统Isolationsystem以无菌技术获得，用现有的方法见不出任何微生物和寄生虫的动物悉生动物（GN）隔离系统Isolationsystem带有明确的微生物丛，无菌条件饲育的动物SPF动物屏障系统Barriersystem不带有指定的致病性微生物和寄生虫的动物普通动物（CV）开放系统Opensystem微生物、寄生虫带有情况不明确，但不能带有人畜共患的和致动物烈性传染病的病原体的动物普通动物实验动物学中将饲养在开放环境中,未经积极的微生物控制,不携带主要人兽共患病和动物烈性传染病病原体的动物称之为普通动物。普通动物是实验动物中再微生物控制上要求最低的动物，这种动物本身所携带的微生物状况不明确，仅要求排除能感染人类的人兽共患病原体如：流行性出血热病毒，LCM病毒，沙门氏菌，致病性皮肤真菌，弓形体和体外寄生虫等，以及能引起动物自身烈性传染病的病原体：鼠痘病毒、兔出血症病毒等。普通动物由于自身所携带的微生物背景不明确，难以排除微生物和寄生虫等对实验结果的干扰，故不适合进行科学研究。清洁动物清洁动物也称清洁级普通动物，是指除一级动物应排除的病原体外，不携带对动物危害大和对科学研究干扰大的病原体的动物。一般国外科学实验采用SPF动物或无菌动物，根据我国目前的发展状况和具体条件，普及SPF动物尚有一定困难。清洁级动物作为之中过渡在我国得到广泛应用。清洁级动物较普通动物健康，在实验过程中可排除动物疾病的干扰，又较SPF动物容易达到质量控制标准，目前可作为一种标准实验动物用于一般科学实验。无特定病原体动物无特定病原体动物简称SPF动物，是指除一，二级动物应排除的病原外，不携带主要潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原体的实验动物。SPF动物来源于吴军动物或剖腹产动物，饲养于屏障系统中，体内及环境中都不存在致病性微生物和寄生虫，属于健康无病动物。SPF动物在广义上也属悉生动物范畴，但带菌的情况不如悉生动物明确，只知道动物排除了哪些微生物和寄生虫，而不知道还携带那些其他生命体，但能安全课可靠地排除微生物和寄生虫对实验的干扰，目前已广泛应用于药物学、病毒学、肿瘤学、免疫学、传染病学、多种诊断血清和疫苗的产生，以及生物制品的鉴定中。无菌动物（Germfreeanimal,GFA）无菌动物是指现有技术手段从动物体内外检查不到其他生命体的动物。无菌动物来源于无菌的剖腹产，然后将仔兽转移到绝对屏障系统——隔离器中，经人工哺育或无菌动物代乳饲育而成。其微生物控制要求是用现有技术手段检测不到任何微生物和寄生虫。悉生动物(Gnotobioticanimal,GNA)悉生动物又称已知菌动物（animalwithknownbactericlfflora）,一般是指动物体内所携带的其他生命体是已知的，并在屏障系统内饲养的动物。广义的悉生动物包括无