动物细胞培养基本技术与原理

动物细胞培养基本技术与原理第一页，共六十九页，2022年，8月28日细胞与组织培养（体外培养）(cellandtissueculture)：

从机体中取出组织或细胞，模拟体内生理条件在体外进行培养，使之生存和生长。包括三个层面：器官培养、组织培养、细胞培养分别代表细胞水平、组织水平或器官水平的培养第二页，共六十九页，2022年，8月28日动物细胞培养的主要领域及意义动物细胞的培养特性动物细胞培养的生存条件主要讲3方面问题：第三页，共六十九页，2022年，8月28日一、动物细胞培养的主要领域及意义

单克隆抗体与现代医学动物胚胎孵育与畜牧业动物细胞培养与现代医药业动物克隆的广泛应用第四页，共六十九页，2022年，8月28日1.单克隆抗体技术与现代医学单克隆抗体技术步骤：*骨髓瘤细胞(myelomacell)特定抗原免疫刺激的B淋巴细胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合

杂交瘤细胞(hybridomacell)。第五页，共六十九页，2022年，8月28日杂交瘤细胞的特性：*既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridomatechnology)。

第六页，共六十九页，2022年，8月28日单克隆抗体的特性：*具有高度的特异性、灵敏性与准确性应用：临床医学的疾病诊断。生产各种免疫疫苗。用于某些肿瘤的治疗。用于各种基础医学研究。

第七页，共六十九页，2022年，8月28日2.胚胎孵育与畜牧业农畜动物胚胎移植：利用胚胎技术大批量生产优质胚胎，从而可以降低胚胎成本，扩大移植胚的来源。体外受精：加快农畜良种化。利用体外受精技术进行核移植、性别控制和基因导入，工厂化生产遗传性状稳定、生产性能优良的家畜。第八页，共六十九页，2022年，8月28日类型动物细胞培养的产物

人疫苗小儿麻痹症、狂犬、风疹、脑炎、乙肝表面抗原、疱疹、某些癌症动物疫苗口蹄疫、鸡瘟病、猪霍乱、马脑炎、牛痢疾、犬瘟、草鱼出血病酶

尿激酶、细胞色素P450、胃蛋白酶、胰蛋白酶、纤维蛋白溶酶原激活剂、胶原酶、酪氨酸脱羧酶激素

促红细胞生成素、促间质细胞激素、绒毛膜促性腺激素、促黄体激素、促滤泡激素、生长激素免疫调节因子白细胞活化因子、转移抑制因子、胸腺素、白细胞介素、干扰素、血清胸腺因子、巨噬细胞毒力因子、β-细胞生长因子

3.动物细胞规模化培养与现代医药治疗性抗体抗体药物第九页，共六十九页，2022年，8月28日4.动物克隆技术有益应用动物克隆技术的应用前景：（1）保存优良的动物品种（2）拯救濒临灭绝的珍惜动物（3）利用克隆动物工厂生产蛋白质药物（4）利用克隆技术生产人体器官第十页，共六十九页，2022年，8月28日第十一页，共六十九页，2022年，8月28日二、动物细胞特性动物细胞在活体内的特性培养条件下动物细胞生长特性培养条件下动物细胞生理特性第十二页，共六十九页，2022年，8月28日1.动物细胞在活体内的特性在活体内，动物细胞:分化的动物细胞在功能上具有明确的分工，并具有明显的形态学特征。

如肌肉细胞为纺锤形，以便于行使收缩伸展功能；神经细胞具有很长的分支，很多的纤维，以便接受和传递刺激；红细胞呈园盘状，有利于和周围环境交换气体和在血管内流动；上皮细胞由于它要覆盖于表面，常常相互挤压成不规则形状。增殖分化第十三页，共六十九页，2022年，8月28日活体内的动物细胞按照分裂能力可以分为三大类：第一类是能保持继续分裂能力的细胞，可以继续不断地分裂，如骨髓干细胞、各类前体细胞；第二类细胞群是永久失去分裂能力的细胞，如各类高度特化的细胞；第三类是静止细胞群，即所谓的G0细胞，在正常情况下，它们不分裂，也不合成DNA，但在受到刺激后，则重新进入细胞分裂。如人的肝脏细胞等。第一类和第三类细胞在适当条件下可进行离体培养。第十四页，共六十九页，2022年，8月28日2.培养条件下动物细胞的生长特性离体培养的动物细胞可分为：

贴壁依赖型(anchorage-dependent)非贴壁依赖型(anchorage-independent)兼性贴壁细胞第十五页，共六十九页，2022年，8月28日1）贴壁依赖型简称为贴壁细胞，包括成纤维细胞型、上皮细胞型、游走细胞型、多形性细胞型。

成纤维细胞型

细胞形态与体内成纤维细胞形态相似，胞内呈梭形或不规则三角形，中央有园形核，胞质向外伸出2～3个长短不同的突起。细胞群常连接成网，生长时呈放射状或火焰状。除真正的成纤维细胞外，心肌、平滑肌、成骨细胞培养时均属这一类型。第十六页，共六十九页，2022年，8月28日游走细胞型

在支持物上分散生长，不连接成片，细胞胞质常伸出伪足或突起，呈活跃的游走和变形运动，速度快而方向不规则。在一定条件下，可转变为成纤维细胞型。多形性细胞型

某些组织和细胞，如神经细胞，难以确定它们的稳定形态，可统归于多形细胞型。nervecell第十七页，共六十九页，2022年，8月28日第十八页，共六十九页，2022年，8月28日2）非贴壁依赖型

也称悬浮型，这类细胞培养时不贴附于支持物上，可在培养液中悬浮生长。来源于血液、淋巴组织的细胞，许多肿瘤细胞等均属于此类，细胞一般呈圆形。

3）兼性贴壁细胞

动物细胞培养中，有些细胞呈现双重性，既可以贴壁生长，也可以悬浮培养，如中国地鼠卵巢细胞、小鼠L929细胞等。

第十九页，共六十九页，2022年，8月28日4.培养条件下动物细胞的生理特点1）动物细胞的分裂周期长动物细胞分裂周期一般为12～48小时，它不仅随细胞种属的不同而有差异，即使是同一种属，不同部位的细胞所需的时间也不同。此外，培养条件如温度、pH、培养基的成分等，也会影响分裂周期的长短。第二十页，共六十九页，2022年，8月28日第二十一页，共六十九页，2022年，8月28日2）接触抑制(contactinhibition)现象除少数悬浮培养细胞外，大多数正常二倍体细胞的生长都需要在一定的基质（如玻璃、塑料等）上贴附，伸展后才能增殖。当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片即每个细胞与其周围的细胞相互接触时，细胞就停止增殖，即细胞密度不再增加，这一现象称之为接触抑制或密度依赖抑制现象。第二十二页，共六十九页，2022年，8月28日3）有限细胞系和永久细胞系动物细胞离体培养起始物--原代培养（primaryculture）经继代培养后即成为有限细胞系(finitecellline)。有限细胞系即使培养条件均能满足细胞繁殖生长，它们也只能在有限的时间内生存，一般经过30~50世代后细胞将逐渐死亡。第二十三页，共六十九页，2022年，8月28日“代”：继代次数和存活时间的长短因细胞来源的年龄和种族不同而有差异。年龄越大继代次数越少。人胚成纤维细胞约可以培养50代，而成年人的成纤维细胞则不能继代50次，同样是成纤维细胞，取自鸡胚的成纤维细胞可继代培养30代，而小鼠的只能培养8代。

第二十四页，共六十九页，2022年，8月28日大多数细胞系在有限的代数内以不变的形式增殖，当超过有限世代后，它们可能有两种情况：一是衰老死亡，二是发育成永久细胞系或称连续细胞系。有限细胞系转换成永久细胞系的过度期称为转换期(crisis)，其转换过程在动物细胞培养中称为体外转化(invitrotransformation)。永久细胞系有如下特征：细胞形态变化，如细胞变小，黏附性减少，具有较高的核质比；生长速率增加，倍增时间缩短；对血清的依赖性减小；贴壁依赖性降低；细胞异倍体和非整倍体增加，细胞接种到体内后，生癌率上升。永久细胞系的建立是动物细胞规模化培养的前体。

第二十五页，共六十九页，2022年，8月28日4）动物细胞的环境敏感性动物细胞与微生物和植物细胞相比，其培养难度要大一些，其主要原因是动物细胞只有细胞膜，而没有细胞壁的保护。动物相比对培养环境十分敏感，一切影响细胞膜变形的因素都会影响动物细胞存活。动物细胞培养对营养条件的要求也十分复杂。

第二十六页，共六十九页，2022年，8月28日三、动物细胞的环境要求第二十七页，共六十九页，2022年，8月28日1.动物细胞培养的环境要求1）无污染环境2）温度

昆虫细胞培养温度一般是25～28℃哺乳动物细胞的培养温度一般是37℃。

总体上讲，动物细胞忍受低温的能力比忍受高温的能力强。如哺乳动物细胞在45℃下只能存活1小时，但在25℃条件下仍然能慢速生长，并维持长时间不死，甚至在4℃下数小时后，再置于适宜温度下细胞仍然可以正常生长。液氮冻存。第二十八页，共六十九页，2022年，8月28日3）pH

动物细胞培养适宜的pH一般在，低于6.8或高于7.6都不利于细胞生长，严重时会导致细胞死亡。培养细胞对pH的要求因培养时间长短有关，一般原代细胞要求较严格，而永久细胞系对pH具有较强的忍耐性。

第二十九页，共六十九页，2022年，8月28日4）气体环境及溶氧一般细胞在培养初期要求较低的溶氧水平，而在对数生长期或培养后期，对溶氧水平要求增加，如果供氧不足，将导致细胞缺氧而死亡。除了氧气供应外，还应注意培养基的氧气和CO2的平衡。第三十页，共六十九页，2022年，8月28日5）渗透压动物细胞培养渗透压包括两个方面的问题：培养基的渗透压维持细胞体内的渗透压维持

大多数动物细胞对渗透压的忍耐程度较强，只要培养基的渗透压变化不是很剧烈，一般对培养物不会造成致命伤害。动物细胞渗透压的维持一般采用平衡盐溶液。

第三十一页，共六十九页，2022年，8月28日四、动物细胞培养第三十二页，共六十九页，2022年，8月28日基本概念和基本步骤:取材分离和组织消化细胞计数常用培养法细胞的常规检查细胞系与克隆动物细胞的大规模培养细胞的冻存与复苏第三十三页，共六十九页，2022年，8月28日一、基本概念（generalconcept）：细胞培养（cellculture）：将动物组织或细胞分散成单个细胞，在模拟机体内的生长环境条件下，使其在体外环境继续生长增殖的过程。原代（初代）培养：指将机体取出的组织或细胞进行初次培养的过程。原代培养的细胞大约增殖10代左右，称为原代细胞。传代（继代）培养：从原代培养的细胞继续转接培养，称为传代培养。传代培养的细胞称为传代细胞。第三十四页，共六十九页，2022年，8月28日二、取材、分离和组织消化(todrawthematerialsfromtissue，separation，digestion)（一）取材——获取组织原则上各种动物组织都可进行体外培养，而实际上幼龄组织（尤其是胚胎组织）比老龄组织容易培养、分化程度低的比分化程度高的容易培养、肿瘤组织比正常组织容易培养。取材前要对所取组织的各种情况进行详细记录；所用器皿用前严格消毒灭菌，取材时严格无菌操作。第三十五页，共六十九页，2022年，8月28日取材方法:

处死动物→取出组织块，放入小烧杯中→用尖嘴眼科剪刀将组织块剪碎（1mm3），用吸管吸取Hanks液冲下剪刀上的碎块，补加3~5mlHanks液，用吸管轻轻吹打；→低速离心，弃去上清液，留下组织块。（也可用手术刀片将组织块切碎，优点：对细胞损伤较小，缺点是操作时间长，容易污染）→对某些软组织碎组织块，可放入注射器玻璃管中或1mm不锈钢/尼龙网筛挤压分离。第三十六页，共六十九页，2022年，8月28日（二）组织消化(tissuedigestion)

用生物化学的方法将剪碎的组织块分散成细胞团或单细胞。1、常用消化液适用范围（1）胰蛋白酶：适用于细胞间质较少的软组织，如胚 胎、羊膜、上皮、肝、肾、传代细胞等。（2）胶原酶：适用于纤维组织、上皮组织、癌组织等。（3）其他酶：链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶等，根据酶的作用特点及组织成分不同适当选用（4）EDTA：最适于消化传代细胞时，常与胰蛋白酶配合使用。 第三十七页，共六十九页，2022年，8月28日2、组织消化操作方法(tissuedigestionmethodofoperation)（1）胰蛋白酶消化(trypsindigestion)①将剪碎的组织块放入有玻璃珠的三角烧瓶中，加入30~50倍体积的0.25%胰蛋白酶；②37℃水浴内消化30~60min，每5~10min摇动一次。根据效果可中间更换消化液。（静止10min，吸去2/3上清液，补加新鲜胰蛋白酶）③Hanks液漂洗两次，每次2~3min；④800r/min离心5min，弃上清液，加入营养液。如有大块，可用纱网过滤。如消化传代细胞，可与EDTA混用。第三十八页，共六十九页，2022年，8月28日（2）胶原酶消化(collagenaseenzymaticdigestion)①培养瓶中放入1~5mm3大小的碎组织块，加5ml2000u/ml的胶原酶溶液，使终浓度为200u/ml，pH6.5；②36.5℃水浴24~48h，视情况可适当延长，无需摇动。期间可更换酶液一次；③见组织块已变软，分散于瓶底时，轻微震荡使散成细胞团或单细胞。小心倒出培养液，瓶底可能附着一些巨噬细胞，借此可将其分开（单独培养或弃之不用）；④800r/min离心5min，弃上清液，重悬于BSS液中，再重复离心一次；⑤加入培养液制成细胞悬液，用于接种。第三十九页，共六十九页，2022年，8月28日三、细胞计数(cellcounting) ——计数悬浮液中细胞的形态及浓度，以判断消化或稀释程度（亦用于培养液中细胞浓度的检查）①染色：在干净的离心管中加入9滴细胞悬液，再加入1滴0.4%台盼蓝，混匀，静置2~3min；②充池：在计数板盖片边缘加入1~2滴染色的细胞悬液，使之完全充满计数板与盖玻片间的空间（无气泡或溢出）第四十页，共六十九页，2022年，8月28日第四十一页，共六十九页，2022年，8月28日③计数：在显微镜下记录计数板四角四个大方格中的活细胞（不染色细胞）总数。一团细胞按一个细胞计数。压线细胞，数上不数下，数左不数右。④计算：

细胞悬液浓度（细胞个数/ml）=（4大格细胞总数/4）×104×稀释倍数注意：如细胞团数超过10%，说明消化不充分。细胞接种浓度：3~10×105/ml第四十二页，共六十九页，2022年，8月28日四、常用培养法(generalcultivation)（一）组织块培养法(tissuepiececultivation)

将组织块剪切成小块，直接放入培养瓶中，贴附一段时间后，细胞从组织块长出，最终形成单层细胞。第四十三页，共六十九页，2022年，8月28日1、悬滴培养法(dropculture)——最简单、最原始的培养法悬滴培养法缺点：细胞生长空间狭小气体不足，不能持续长时间生长培养基易液化，需要常更新培养基凹玻片折光，不便于观察。第四十四页，共六十九页，2022年，8月28日2、旋转管培养法(rotatetubeculture)①组织块或细胞可交替地接触营养液和空气，利于细胞生长；②培养管缓慢转动，使整个管内壁全部长满细胞，提高了细胞产量，适于较大量的组织培养和各种长期传代细胞的培养。缺点：不易在显微镜下观察。3、灌注小室培养法(dabblebooth

cultivation)为大规模培养系统提供了参考原理。第四十五页，共六十九页，2022年，8月28日4、卡氏瓶培养法卡氏瓶(carlsberg'sflask)（如下图）：①将组织块剪碎，BSS漂洗。②转移到另一只培养皿，在解剖显微镜下去掉不需要的组织如脂肪、坏死组织等。将组织块切成1mm3小块。③用预先润湿的滴管转移到消毒离心管，静置使组织小块下沉，吸去上清。以新鲜BSS漂洗。重复2~3次。第四十六页，共六十九页，2022年，8月28日④转移到培养瓶（每个25ml的培养瓶可放置20~30块组织小块），吸去液体。加入1ml生长培养液，轻斜摆动培养皿，使组织小块均匀分布。盖好瓶盖，36.5℃培养18~24h。⑤待组织块粘附瓶壁后3~5天，加入5ml培养液；然后每周更新培养液一次。培养3~5周，细胞不断增长，肉眼或低倍镜下观察可见围绕组织周围生长犹如日晕，称“生长晕”。⑥取出中央组织块，用预先湿润的滴管移到另一新的培养瓶。重复④~⑥操作。⑦在原生长晕培养瓶内换入新鲜培养液。待生长晕细胞扩展至约50%培养瓶底表面时，进行细胞培养。第四十七页，共六十九页，2022年，8月28日（二）单层细胞培养法(monolayermethod)

组织块经胰酶消化分散成较小的细胞团或单个细胞，在合成培养液中附在瓶壁上长成单层，即形成所谓单层细胞培养。

1、原代培养(primaryculture)（初代培养）第四十八页，共六十九页，2022年，8月28日第四十九页，共六十九页，2022年，8月28日2、传代培养(serialsubcultivation):传代的理想时期：对数生长期，细胞80~90%或刚刚全部汇合。方法：①消化：加入胰蛋白酶或胰蛋白酶与EDTA混合液，盖满瓶底，作用2~5min；②检查：如细胞间隙变大，细胞质回缩，则终止消化。③终止消化：吸出消化液；加入Hanks液，轻轻转动，洗去残留的消化液。如单用胰蛋白酶，可直接加入培养液。③细胞计数：用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落，制成悬液，计数并记录其浓度；④重新稀释接种培养。第五十页，共六十九页，2022年，8月28日根据细胞特点，掌握细胞消化时间和选择消化方法。第五十一页，共六十九页，2022年，8月28日（三）组织块单层细胞培养法(tissuemonolayermethod)

把组织剪成更小的小块（0.5~1mm3），由于其体积很小，无需任何粘着剂即能直接附于瓶壁上。细胞自组织块边缘向外长出，最后连接成片，形成单层细胞。优点：简化了原代单层细胞的培养过程。是当前各培养室常用的原代培养法。第五十二页，共六十九页，2022年，8月28日方法：①取一定量组织置于小烧杯中，先用BSS漂洗2~3次去掉血污，然后反复剪成0.5~1mm3的小块。②加入1~2ml培养液，用吸管轻轻吹打，使组织块悬浮。③移入培养瓶，并在瓶壁上吹匀。翻转，使有组织块的瓶壁朝上，加入培养液，塞紧瓶口，置37℃温箱培养1~2h；待组织牢固贴于瓶壁，再轻轻翻转，使培养液浸泡组织小块，静止培养。为促进细胞贴壁，也可先在瓶内壁涂一层血清。第五十三页，共六十九页，2022年，8月28日第五十四页，共六十九页，2022年，8月28日（四）悬浮细胞培养法(suspendedcellculture)

利用旋转、振摇或搅拌的方法不让细胞贴壁，使其在培养液中呈悬浮状态生长。适用细胞：淋巴细胞、肿瘤细胞、传代细胞系培养基：合成培养基＋5~10%血清＋0.1%甲基纤维素培养细胞密度：5~7×105cell/ml.特点：细胞增殖快，产量高，培养过程简单，是动物细胞大规模培养的理想模式。第五十五页，共六十九页，2022年，8月28日（五）微载体培养法(microcarrierculture)载体：DEAE-交联葡聚糖微粒、DEAE-纤维素、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、无机玻璃基质微载体等微载体培养系统培养细胞步骤：1、选择合适的微载体类型——获得最大量的细胞，以微载体能全部悬浮在培养液内为最好2、浸泡水化及消毒 用无Ca2+、Mg2+离子的磷酸缓冲液浸泡3h以上3、接种（根据细胞类型决定接种浓度）4、培养观察与细胞计数5、消化6、分离细胞或传代培养第五十六页，共六十九页，2022年，8月28日（六）多孔载体培养(porositycarrierculture)优点：增加细胞固定化稳定性，比表面积大，保证细胞充分的生长空间，细胞生长在载体内部，免受机械损伤。多孔载体被证明是用于大规模高密度细胞培养的优秀细胞生长支持物，具有逐步取代传统的实心微载体的趋势。（七）中空纤维细胞培养法(hollowfibercellculture)

模拟细胞在体内生长的三维状态，利用人工的“毛细血管”——中空纤维来供给细胞生长的营养等条件细胞向三维空间生长繁殖，形成类似组织的多层细胞群体，细胞密度可达109个/ml。适用于细胞代谢产物和分泌物的生产。第五十七页，共六十九页，2022年，8月28日五、细胞系与克隆株（celllineandclone）1、细胞系的建立

原代培养的培养物中所含的细胞类型多而复杂，培养初期，生长的细胞类型多种多样随培养时间延长：一些细胞退化、死亡；另一些细胞适应环境而生长繁殖培养物逐步变均匀。传代培养意义：不仅在于维持细胞不断地生长，而且使培养物逐步演变为具有增殖能力、特征专一、类型均匀的培养细胞，即细胞系。细胞系：*指从原代培养物经传代培养后得来的一群特征专一、类型均匀的细胞，可以长期连续传代。第五十八页，共六十九页，2022年，8月28日（1）限定细胞系（有限细胞系） 寿命有限，一般为20~80代（2）连续培养细胞系（无限细胞系） 细胞发生转化，可连续培养和生长，寿命变为“无限”2、克隆株（细胞株） 分离单一细胞并使其繁殖形成的细胞群称为细胞株。单个细胞的生活能力很弱，必须采取特殊的培养措施适应和同化过程：在细胞接种到新培养液的初期，细胞既从培养液中摄取营养，也要向培养液排出一定物质，其结果使得培养液更易被吸收和利用。

第五十九页，共六十九页，2022年，8月28日适应培养液

制备：选择生长状态良好的对数生长期细胞，无死细胞和碎片，所用细胞的种类应与要克隆的细胞相同。吸出培养液，用G6滤器过滤贮于冰箱中备用。 制备适应性培养基时注意：选用成分齐全的合成培养基，可不加抗生素。第六十页，共六十九页，2022年，8月28日细胞株的制备方法（3种）：（1）集落形成分离法平皿中接种稀释细胞细胞贴壁繁殖成许多小群选择一个最好的细胞群做标记机械法刮除所有其他细胞群培养保留下来的细胞群.第六十一页，共六十九页，2022年，8月28日克隆成功的关键：①接种细胞数量要合适、细胞要分散得好。太多则使细胞操作不便，以每个平皿50~100个细胞为宜。②选择细胞克隆时，应逐日观察，能证明被选留的细胞群确系来自于单个细胞。刮除和洗涤一定要彻底。第六十二页，共六十九页，2022年，8月28日（2）琼脂分离法（agarSeparation）琼脂培养基的制备：

选择质量好的琼脂，用三蒸水配成3%的溶液，分装，灭菌。培养方法：向琼脂平皿中接种稀释细胞悬液（适应培养基），培养后，标记出保留细胞，在显微镜下切下保留细胞处琼脂小块，在BSS中轻轻漂洗后，用适应培养基继续培养。第六十三页，共六十九页，2022年，8月28日（3）多孔塑料板分离法（foamedplasticsSeparation） 将1ml含有7~8个细胞的悬液接种到多孔无毒塑料板中，每一块板上有数十个圆形小穴。选择仅有单个细胞的