临床微生物检验基本技术标准操作规程

临床微生物检验基本技术标准操作规程TOC\o"1-5"\h\z微生物检验实验室标本处理标准操作规程 137微生物检验实验室标本接种标准操作规程 138微生物检验实验室细菌鉴定操作规程 139微生物检验实验室不染色标本检查法标准操作规程 140微生物检验实验室革兰染色标准操作规程 141微生物检验实验室抗酸染色标准操作规程 142微生物检验实验室墨汁染色标准操作规程 144微生物检验实验室药物敏感试验标准操作规程 145XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书标本处理标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0562版本：20140601生效日期：20140615共1页.目的规范标本处理标准操作规程。.范围临床微生物标本。.职责微生物检验人员严格执行本程序。.程序血液标本、接收标本后，立即对标本进行编号、登记。门诊病人要同时登记住址、联系电话等信息。将血培养瓶置于全自动培养仪中培养。痰标本接收编号、登记后的痰标本，加入痰消化剂或无菌生理盐水处理。用无菌棉签挑取标本分别涂布于血琼脂平板、巧克力琼脂平板，麦康凯平板的第一区，然后用接种环划第二、第三区 同时做痰涂片镜检。咽拭子标本涂布于血琼脂平板、巧克力琼脂平板、麦康凯平板第一区，然后用接种环划第二区、第三区 脑脊液、胸腹水等穿刺液床边抽取体液标本1-2ml注入多功能体液培养瓶或需氧血培养瓶，即送实验室。接收标本后，立即对标本进行编号、登记，置孵育箱培养。脑脊液标本需离心涂片检查。粪便或肛拭标本接收标本后，立即对标本进行编号、登记，

取粪便脓血部位标本根据检验申请单要求选择平板，立即接种。尿标本接收标本后，立即对标本进行编号、登记，将尿标本混匀，用10ul定量接种环立即接种血琼脂平板、麦康凯平板，分离细菌和菌落计数。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]叶应妩，王毓三，中子瑜主编.全国临床检验操作规程.第3版.南京：东南大学出版社，2006编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人： XXX医院检验科

微生物检验实验室标本接收标准操作规

程文件编号：XXX医院检验科

微生物检验实验室标本接收标准操作规

程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0563作业指导书版本：20140601生效日期：20140615共1页.目的规范标本接种标准操作规程，确保检验结果准确可靠。.范围微生物所有标本的接种。.职责微生物检验人员严格执行本程序。.程序分区划线法此法多用于粪便等含菌量较多的标本。用接种环先将标本涂布在平板第一区并作数次划线，再在二、三 区依次用接种环划线。每划一个区域，应将接种环烧灼1次，待冷却后再划下一个区域。每一个区域的划线应接触上一个区域的接种环2-3次，使菌量逐渐减少，以形成单个菌落。斜注平板法本法用于尿液等标本的细菌计数。将灭菌生理盐水适量稀释的标本1ml,置于灭菌平皿内，注入已熔化并冷却至50℃左右的培养基15ml,混匀，待冷却后，倒置。斜面接种法此法主要用于鉴定或保存菌种，或观察细菌的某些生化特性和动力。用左手握住菌种管和斜面培养管底部，右手持接种环。用右手小指于手掌、小指于无名指分别拔出两管的棉塞，将管口通过火焰灭菌。用接种环伸入菌种管内挑取移种之菌落。伸入斜面培养管内，先从斜面底部到顶端拖一条接种线，再自下而上蜿蜒划线，或直接自下而上蜿蜒划线。将接种环垂直插入半固体培养基的中央，穿刺至培养基底部，然后穿刺线推出接种环。穿刺培养法此法用于保存菌种，观察动力及某些生化反应。以接种环挑取细菌培养物，插入半固体培养基的中央，穿刺至培养基底部，然后沿原穿刺线退出接种环。液体培养基接种法用灭菌接种环挑取菌落或标本。在试管内壁于液面交界处研磨，使细菌混匀在液体培养基中。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]叶应妩，王毓三，中子瑜主编.全国临床检验操作规程.第3版.南京：东南大学出版社，2006编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人： 文件编号：文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0564版本：20140601生效日期：20140615共1页XXX医院检验科微生物检验实验室作细菌鉴定操作规程业指导书1.目的规范细菌鉴定标准操作规程。2.适用范围革兰阴性菌、革兰阳性菌等。3.职责检验人员严格执行本程序。4.程序观察菌落大小、颜色、气味、溶血、形态特征等，观察内容应记录在《细菌鉴定流程表》。涂片，革兰染色，观察染色性及细菌形态、大小和排列，球菌、杆菌或螺形菌等，观察内容记录在《细菌鉴定流程表》。初步生化反应根据菌落特征和涂片结果选择初步生化反应，如氧化酶、触酶、凝固酶（玻片法）等。制定细菌鉴定方案仪器鉴定方案（以VITEK2为例）革兰阴性杆菌：选择GN卡（阴性菌鉴定卡）。革兰阳性球菌：选择GP卡（阳性菌鉴定卡）。酵母菌：选择YST卡（酵母菌鉴定卡）。需氧芽抱杆菌：选择BBL卡（需氧芽抱杆菌卡）。手工细菌鉴定法氧化酶阳性革兰阴性杆菌，选择非发酵鉴定生化反应组合：葡萄糖O/F、木糖、麦芽糖、硝酸盐、动力、七叶苷等生化反应。氧化酶阴性革兰阴性杆菌，选择肠杆菌科细菌鉴定生化反应组合:触酶、硝酸盐、葡萄糖O/F、动力、乳糖、VP、吲哚、甲基红、枸椽酸盐、精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸等生化反应。疑不动杆菌氧化酶阴性革兰阴性杆菌，选择非发酵鉴定生化反应组合。革兰阳性球菌，选择革兰阳性球菌鉴定生化反应组合：触酶、葡萄糖O/F、胆汁七叶苷、蔗糖、木糖、甘露醇、硝酸盐、脲酶等。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999编写人：AAA、BBB 操作人：本室操作人员

批准人： XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书不染色标本检查法标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0565版本：20140601生效日期：20140615共1页.目的规范不染色标本检查法标准操作规程。.范围微生物不染色标本检查。.职责微生物检验人员严格执行本程序。.程序不然色标本检查法主要用于检查细菌的动力及运动状况。有鞭毛的细菌，在显微镜下呈现活泼的运动，湿片法用接种环取细菌悬液或细菌培养液2环，置于清洁载玻片中央，轻轻覆上盖玻片，于油镜下观察。制片时菌液要适量，不可有气泡，不可外溢。悬滴法取洁净的凹窝载玻片及盖玻片各一块，将凹孔四周的平面上涂薄薄一层凡士林，取1接种环菌液置盖玻片中央，将凹窝载玻片的凹面向下，对准于盖玻片的液滴盖上，然后迅速翻转玻片，用小镊子轻轻压，使盖玻片与凹孔边缘粘紧，使凡士林密封其边缘，菌液不致挥发变干。镜下观察时，先用低倍镜，调成暗光，对准焦距后以高倍镜观察，不可压碎盖玻片。有动力的细菌可见其从一处移动到另一处，无动力的细菌呈现布朗运动而无位置改变。螺旋体由于菌体纤细、透明，需用暗视野或位相显微镜观察其形态、活动。毛细管法主要用于检查厌氧菌的动力。以毛细管（长60〜70mm,管径0.5〜1.0mm）接触培养物，让菌液吸入毛细管后，用火焰

将毛细管两端熔封，将毛细管固定在载玻片上，镜检。考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999（周庭银）编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人： XXX医院检验科

微生物检验实验室作革兰染色标准操作规

程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-056XXX医院检验科

微生物检验实验室作革兰染色标准操作规

程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-056业指导书6版本：20140601生效日期：20140615共1页.目的规范革兰染色标准操作规程。.原理细菌样本先经紫色草酸盐结晶复合物染色，之后用Lugol-PVP媒染剂处理以促进燃料与革兰染色阳性菌结合。经酒精-丙酮的脱色作用，革兰染色阴性菌中的结晶紫会被洗脱。番红精则是作为复染剂：革兰染色阴性的细菌呈现粉红色，而革兰染色阳性的细菌呈现紫色。。.试剂结晶紫草酸盐溶液结晶紫2%；酒精20%；草酸铵0.8%。稳定Lugol-PVP复合物碘1.3%；碘化钾2%；PVP（聚乙烯吡咯烷酮）10%。脱色剂95%酒精50%；丙酮50%。番红精溶液番红精0.25%；95%酒精10%。.质控采用大肠埃希菌ATCC25922质控菌株，每周1次，有室内质控记录。采用金黄色葡萄球菌ATCC25923质控菌株，每周1次，有室内质控记录。。.操作步骤初染第一液初染剂（结晶紫）染色1分钟，水洗。媒染第二液媒染液（碘液）染色1分钟，水洗。脱色第三液脱色剂（95%酒精）用到无紫色脱落为止，水洗。复染第四液复染剂（石碳酸复红或沙黄）染色30秒，水洗。自然干燥后镜检。.结果判断革兰阳性菌呈紫色，革兰阴性菌呈红色。.注意事项染色的结果常受操作者技术的影响，尤其是容易过度脱色，往往阳性染成阴性。在同一载玻片上，需用已知金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌作革兰阳性及阴性对照。染色关键在于涂片和脱色，涂片不宜过厚，固定不宜过热，脱色不宜过度。菌龄为18〜24小时为佳。.临床意义鉴定细菌可将细菌分为阳性和阴性两大类，因而可以初步识别细菌，缩小范围，有利于进一步鉴定。选择药物革兰阳性菌与阴性菌的细胞壁结构有很大差别，因而抗菌药物有差异。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编实用医学培养基手册.北京：人民军

医出版社，1999（周庭银）编写人： AAA、BBB 操作人：本室操作人员批准人： XXX医院检验科微生物检验实验室作抗酸染色标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-056

业指导书7版本：20140601生效日期：20140615共2页.目的规范抗酸染色标准操作规程。.原理抗酸菌具有耐受酸性介质脱色的生物状，此类细菌在石碳酸（苯酚）的协同作用下，被复红染色剂着色，能够耐受酸性酒精脱色，显微镜观察时保持紫色红色；而其他脱落细胞或标本中的非抗酸菌被酸性酒精脱色，可被复染剂亚甲蓝染为蓝色。.试剂Kinyoun溶液。碱性品红40g乙醇（95%）200ml石碳酸80ml蒸馏水1000ml3.2Gabett溶液亚甲蓝10g无水酒精300ml硫酸200ml蒸馏水500ml.质控每天用龟分支杆菌ATCC93326做阳性对照，大肠埃希菌ATCC25922做阴性对照。.操作步骤初染涂片上滴加石碳酸复红液，用火焰加热至产生蒸汽，约5分钟，水洗。脱色第二液脱色约1分钟，轻轻摇动玻片，无红色脱色或略呈粉红色时为止，水洗。复染第三液复染30秒，水洗。自然干燥后镜检。.结果判断抗酸杆菌呈红色。.注意事项每张玻片只能涂一份标本，禁止将2份或2份以上的标本涂在同一张载玻片上。为防止交叉感染，标本应先高压灭菌后再涂片染色。在涂抹痰标本时，严禁对载玻片进行加热。菌龄为18〜24小时为佳。.临床意义只针对用于结核病、麻风病等的细菌检查，初步诊断。.安全防护措施操作人员要戴口罩、手套和穿隔离衣。涂片制备痰标本要高压灭菌或者在标本中加入等量 0.5%“84”消毒液（含有效氯2500mg/L）后涂片。气管刷片送检的玻片，紫外线灯下照射30分钟进行染色镜检。或者对于进行抗酸染色的痰标本（因使用的容器原因不能高压灭菌）。镜检后的玻片均浸泡在含有效氯1000mg/L的消毒液中，高压灭菌后处理。所有标本、污染物丢弃之前，都需经高压灭菌、焚烧或浸泡杀菌剂中。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999（周庭银）

业指导书68版本：20140601生效日期：20140615共1页.目的规范墨汁染色标准操作规程。.原理墨汁染色（负染色法）：背景着色而菌体本身不着色的染色法称负染色法。此法用以观察细菌及某种真菌的荚膜等。.试剂印度墨汁。.质控新型隐球菌ATCC32609为阳性，白念珠菌ATCC90038为阴性。.操作步骤脑脊液等其他标本离心取沉淀物或者挑取菌液1环涂于洁净玻片上，然后加印度墨汁1环，覆以盖玻片后镜检。镜下背景呈黑褐色，菌体无色。.结果判断新型隐球菌可呈宽阔透亮的厚荚膜，背景为纤细均匀的黑色，白细胞被染成黑色不透亮，但核形明显。.注意事项不要使用过期的印度墨汁。墨汁应无污染、无颗粒等。.临床意义主要用于新型隐球菌的鉴定。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999（周庭银）编写人:批准人：AAA、BBB操作人：本室操作人员编写人:批准人：AAA、BBB操作人：本室操作人员XXX医院检验科

微生物检验实验室作药物敏感性试验标

准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-056业指导书9版本：20140601生效日期：20140615共2页.目的规范药物敏感性试验标准操作规程，确保药敏结果准确。.原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待检菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后会不断的向纸片周围区域扩散，形成递减的浓度梯度，在纸片周围抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，从而产生透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映检测菌对测定药物的敏感程度，并与该待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。.试剂M-H培养基、无菌生理盐水、药敏纸片、无菌棉签、35℃孵育箱、标准比浊管或比浊仪。.质控常用细菌药敏质控标准菌株参见CLSI规定。质控菌株每日随临床标本一起进行药敏试验，测定质控菌株的抑菌环。质控菌株的抑菌环在允许范围之内，说明结果可信。质控的频率由于纸片法药敏试验是很稳定的，在不失控的时候，可以每周作1〜2次质控菌株的测定。如果发现有失控的情况，就必须每日做1次，寻找失控的原因并予以纠正。如果连续30日失控＜3次的，可以恢复每周1次。.操作步骤挑取4〜5个纯