DB33-T 963-2015(2019)厚皮甜瓜种子纯度分子标记鉴定方法

ICS65.020.01B05

DB33浙 江 省 地 方 标 准DB33/T963—2015厚皮甜瓜种子纯度分子标记鉴定方法PurityidentificationofMuskmelonvarietyusingmolecularmarkeranalysis2015-05-07发布 2015-06-07实施浙江省质量技术监督局 发布DB33/T963DB33/T963—2015II前 言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由浙江省农业厅提出。本标准由浙江省种植业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：宁波市农业科学研究院、宁波市种植业管理总站。本标准主要起草人：宋慧、王毓洪、张香琴、臧全宇、陆惠斌、张庆、范雪莲。PAGEPAGE6厚皮甜瓜种子纯度分子标记鉴定方法范围本标准适用于厚皮甜瓜种子纯度鉴定。农业1485公告-4-2010 基植及其品分检测 DNA和下列术语和定义适用于本标准。3.1品种纯度品种在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示[GB/T3543.5-1995，定义3.2]。3.2杂株某差异位点杂交失败，该位点纯合的单株。3.3杂种一代某差异位点杂交成功，该位点杂合的单株。3.4显性标记位点仅能检测显性等位基因，不能够区分纯合和杂合基因型的遗传标记位点。3.5共显性标记位点同时能检测出显性和隐性等位基因，能够区分纯合和杂合基因型的遗传标记位点。3.6随机扩增多态性DNA标记（RAPD）DNA（10TaqDNAPCR3.7简单重复序列标记（SSR），PCR原理PCR试剂除非另有说明，仅使用分析纯试剂和去离子水。引物RAPDRAPD（RandomAmplifiedPolymorphicDNA）引物名称、序列及差异片段大小见表1。表1 RAPD引名、列异片大小名称序列（5’-3’）差异片段大小（bp）RAPD-1ACCTGGACAC1200/1400RAPD-2CCACATCGGT1200/1300RAPD-3ACACCGGAAC1500RAPD-4CCGAACACGG460/550SSRSSR（SimpleSequenceRepeat）引物名称、序列及差异片段大小见表2。表2 SSR物称序及异片大小名称F-序列（5’-3’）R-序列（5’-3’）差异片段大小（bp）SSR-1CAAAGGGCTACAATAACCATCATAATCACCCTATCTC225/350/400/450SSR-2CAGCTCTACAACAACATCTCATCCAACTCGACCAAGAAAC120/130/140/550/600SSR-3TGAAGAGACTACCATCCCCATTTCCTTATGAGTTAGGGTTTC140/150/320/350琼脂糖RAPD2（DNA500bp～20000bp）SSR2.5%（DNA40bp～1000bp）。10g/L称取1.0g溴化乙锭（EB），溶于100mL水中。配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。10mol/L称取80.0g氢氧化钠（NaOH），先用160mL水溶解后，再加水定容到200mL。0.5mol/L（pH8.0）称取18.6g（EDTA-Na2）70mL2解后，冷却至室温，用按本标准5.4配置氢氧化钠溶液调pH至8.0，加水定容至100mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。1mol/L（pH8.0）称取121.1（Tris）800mL42mL1000mL103.4kPa（121℃）20min。TE（pH8.0）10mL2mL5.51000mL。在103.4kPa（121）20min。5×TBE称取54g三羟甲基氨基甲烷，27.5g硼酸，先用500mL水加热搅拌溶解后，加入20mL按本标准5.5配置的乙二胺四乙酸二钠溶液，加水定容至1000mL。使用时用水稀释成0.5×TBE。称取1100mL0.151g二甲1000.151.5mL的0.150.15%100μL5.54gmL4DNARAPD，100bp～2000bpDNADNASSR50bp～1500bpDNADNAdNTPs将浓度为2.5mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸等体积混合。TaqDNAPCR将TaqDNA聚合酶配制成5U/μL使用。0.01。PCR抽样厚皮甜瓜种子按照每批次不少于300粒抽样。取样抽样结束后，播种，待第一片真叶长至0.5cm～1cm时，即可单株取真叶样品，液氮冷冻研磨。DNA按农业部1485号公告-4-2010规定执行。PCRPCRPCR34表3 RAPD的PCR反体系试剂终浓度体积（μL）无菌水/2.572.5mmol/LdNTP0.25mmol/L1.010×buffer1×1.025mmol/LMgCl22.5mmol/L1.0引物5mmol/L0.5mmol/L1.05U/μLTaq酶0.015U/μL0.0310ng/μL模板DNA3.4ng/μL3.4总体积/10表4 SSR的PCR测反试剂终浓度体积（μL）无菌水/2.462.5mmol/LdNTP0.2mmol/L1.210×buffer1×1.525mmol/LMgCl23mmol/L1.8上游引物5mmol/L0.5mmol/L1.5下游引物5mmol/L0.5mmol/L1.55U/μLTaq酶0.0133U/μL0.0410ng/μL模板DNA3.33ng/μL5总体积/15PCRRAPD440（93℃15s，40302minPCRPCR726minSSR140（9311min，72℃1minPCRPCR）；721min。PCRPCRPCR20g/L25g/L0.5×TBE100mL5μLEBEB6030min0.5×TBEPCR7μLPCR2μLDNA200A90V2h～3h4cm～5cm电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪或紫外投