分子生物学-上一届课件lecture8重组技术

重组DNA技术的发展1865年G.J.Mendel1944年O.T.Avery 1973 程公司,专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物1980年开始建造第一家应用重组DNA1985年K.Mullis的聚合酶链式反应技术(PCR)1997年英 成功的克隆了多莉2345工程（geneticengineering进行剪切和重新连接，形成重组的DNA分子，然后将其导入宿主细胞，进行 增，表达有关的 6重组DNA技 binantDNAtechnology 的遗传元件（又称载体）中，形成重 或DN段以产生大量相同DNA分子“拷贝”的技术。7DNA重组 bination）接而形成重新组合DNA分子的过程。重组DNA DNA的DNA分子。8 治 细胞工9DNA克隆的概克隆（clone一群体中的所有细胞具有完全相同的型“克隆”在分子生物学中，是指通过重组DNA( binantDNA)技术获得的具有相同DNA序列的单一或DN段的多个贝(copy)获取同一拷贝的过程,称为克隆化DNA技术是通过一系列操作在 DNA分子克

DNAcloninggenecloningmolecularcloning重组DNA的策略与技术路1、获得目 /目的2、目 与载体的酶切和连3、重组DNA分子导入受体细5、重组DNA分子的扩 重组DNA技术常用的工MolecularTools binantDNA限制性核酸内切DNA聚合酶

1978逆转录T4DNA连接碱性磷酸

DNA聚合（restrictionendonuclease，限制酶）1、定义类能识别双链DNA分子中特核酸内切种类以及是否具有修饰酶活性，分IIIIII通常所指的限制酶为II型限制酶内切II切割位点在识别位点内： Hin

Haemophilusinfluenzaed株流 识别序列一般为4~6bp，通常具有旋转对（二重对称）性或回文结构(4)切割DNA双链可产2种末端：平末端（bluntendsorflushends粘性末端（stickyendsorcohesive粘性末端（stickyendsorcohesiveends）: BamH3’端突出的粘性末

平末端（bluntendsorflushends

4、异源同裂酶/同工异源酶2特点：1）识别相同顺2）切割位点相

GGTACGGTACCCCGCGGCCGCGGGGATCCGGATCC5、同尾酶（称配伍末compatibleend）2）切割后的配伍末端相SalSalXho

+TCGAGC

二、DNA聚合酶（DNApolymerase,DNApolDNA聚合以dNTP为底物，催化dNTP聚模板（template）：需核酸作为模以DNADNA指导的DNA聚合酶以RNA作为模板，RNA指导的DNA聚合引物（primer):含3’-OH末端的低聚核苷酸3’-OH为合成的起始DNA聚合酶：多功能缓冲液1、大肠杆菌DNA聚合酶（E.coliDNApolymeraseI，全酶分子量为109kD，具有三种活性的多功能5’→3’聚合酶活3’→5’外切酶活5’→3’外切酶活2、Klenow酶（大肠杆菌DNA聚合酶I大片段largefragmentofDNApolE.coliDNApol Klenow酶(C端大片段对 将粘性末端转变成钝性末OHG

GAATCTTA CTTA

对5-粘性末端片段，利用大肠杆菌DNA聚合酶I的3、TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase特点1是一种耐热的DNA聚合酶，最佳作用温度为75-80C。2具有5’3’聚合酶和5’3’外切酶活性，缺3’5’外切酶活性， PCR，DNA序列测4、逆转录酶(ReverseTranscriptase,RTase) RNA指导的DNA聚合酶(RDDP，种 禽成髓细胞 Moloney鼠白血 功禽源:聚合酶活性和很强的RNaseH活无3’5’DNA外切酶活性,故无校对功能。用 RT- cDNA文三、DNADNAligase主要有两种：T4噬菌体DNA连接大肠杆菌DNA连接 3’-OH与5’-磷酸基之间形3’5’磷酸二酯将两段 断拼接起连接双DNA）催化ATPγ-磷酸转移到DNA链用途放射性标记DNA链的5’-末端,用于DNA 将人工接头和其它没有5’-末端磷酸的 五、碱性磷酸酶（alkaline作用：催化切除DNA、RNA、dNTP上5用途防止酶切后DNA的自身连从RNA或DNA上除去5’磷酸，与T4核苷酸激酶联合，用于放射性标DNA链的5’末端六、不依赖于模板的DNA聚合(terminaldeoxynucleotidyl末端转移给载体或cDNA加上互补的多聚体尾 段的3’末端标

七、核酸酶 （二）RNase作用于DNA-RNARNA链,用（三）DNase 缺口 切口 断口工具酶 限制性核酸内切识别特异序列，切割DNA连接催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯DNA聚合酶①合成双链cDNA分子或片段连②缺口平移制作高比活探③DNA序列分填补3´Klenow二链合成，双链DNA3末端标记等反转录②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分末端转移在3´羟基末端进行同质多聚物加碱性磷酸切除末端磷酸 载体 克隆的载 义 载体的本质 载体的特征1、能自 ：至少有一 起始（originofreplication，ori）2、具备筛选标记（selectionmarker），便于重组体的筛选和鉴3、在细胞中拷贝数4、有适当的限制性内切酶酶切位（常具有多个单一酶切位点，称多克位点，即MCS-multiple cloningsites，

MultiplecloningATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCAHind

Sph

Pst

SacIAccI

Xba

BamHISmaIKpnXma

Sac

EcoR 能克隆型载体（扩增表达型载宿主细胞真核细胞载体达/穿梭原核细胞载体(克隆/表达)载体来源质粒载体、 嗜菌体载体、昆虫载体质粒载体是最常用的载 酵母人 载体（Yeast 疱 、腺相昆虫载（一）质粒的概念、种质粒是存在于多数细菌和某些真核生 分子生物学中常用的质松弛型质粒（须经人工改造作为克隆载体的质粒应具备下列特具有一个以上的遗传标志，便于对如：抗生素的抗-半乳糖苷 （Lac 某种标 的插入失活,便于筛选的、携带目的DN段进入宿主细胞进行1 度 筛选方法：双抗生素对照筛1000—3000个拷贝。 度:2.69筛选标记多克隆位点方向ATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCA

EcoR

Sac

KpnISmaIBamHXma

SacXba Acc

Pst

Sph

HindATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCAHind

Sph

Pst

SacIAccI

Xba

BamHISmaIKpnXma

Sac

EcoRPrimer与待测核酸模板特异互补的寡聚核苷酸单链(自行设计)载体pUC18/19pGEM通用引物T7引物、T3载体DNA

待 通 引引合成新

载体DNA序3、 pcDNA3.1(+)(5428 质粒载

真核表达载克隆载体(cloning保存和扩增小于2kb的 构建cDNA文用于目的DNA表达载体的表达载体(expressionvector为使插入的外源DNA序列在受体细胞中可 段较小(<2kb) 噬菌体 结构不同，生物学性状不同噬菌体载体的结构不同，用途不同双链噬菌体载体（λλ噬菌体gt系 含 、λ菌体的生物学特组特点：双链线性有长12bp（cos位点，粘端）溶菌性生长（裂解性生长（lytic溶源性生长（lysogenic 衣壳蛋粘性末

调控粘性末Cos位点（Cohesive-endλDNA为线状双链分子，两端各有12

crocII

DNA

DNA必须由外壳蛋白包装后方可形成完整的，才能感噬菌体大肠杆菌要比质粒转化细噬菌体载体的克隆操作要DNA长度的限制： <EcoR

EcoR

λgt10λgt11λgt10和λgt11载体都属插入型载体，适用于（2）替换载体(subsitutionorreplace组中14kb的非必需区，可被非必需区两侧有一对限制性酶切位如

EcoRIBamHISalI闭环单股正链在细菌内形成过渡的双链环状以 单链形式分泌到培养基M13载体优点：产生单链型DNA（RF Replicativeform含 M13mp18和M13mp19的差别多克隆位点方向ATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCAEcoR

Sac

KpnISmaIBamHXma

SacXba Acc

Pst

Sph

HindATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCAHind

Sph

Pst

SacIAccI

Xba

BamHISmaIKpnXma

Sac

EcoR+提取提取 如 载腺相 载逆转 载载体容

<<4<<48kb(40-~1000四、表达载体（expression表达系统表达目的、合成目的真核细胞表达载载体的元件：克隆载体的基本元表达元原核细胞表达载体原核生 的表达元启动真核细胞表达载体

真核生 的表达元增强启动

重组DNA的基本过2、切：对目 和载体适当切3、接：目 与载体连4、转：重组DNA5、筛：筛选出含有重组体的受菌 （target 或外源性DNA 的常用方法 （一）直接 组DNA获得目 由于真核生 组复杂，不用此法获得目 （二 文库的构建和筛选目genelibrary组文cDNA文

GenomicLibrarycDNALibrary文库（gene两类 组文cDNA文组文库（genomic将某种生物细胞的组DNA切割这些含有一个有机体组DNA的重 组序 1、提 组DNA酶2、 段(酶切)与载体的连接及包载体(噬菌体

3、导入受体细胞：噬菌 细4、筛选目 免 cDNA表达的蛋白质牢固结合在膜上。抗体结合,放射自显影,挑取阳性克隆。cos R

cos左

R右

~20KbDNAcos

~20Kb外源DNA片 R

特点及应1、包含所有遗传信息（内含子、外显子2、构建难度大（单拷 、长片 3、筛选难度4、用于研 组中的情cDNA文库(cDNA cDNA克mRNA特点cDNA文库仅包含正在表达 (外显子具有组织细胞特异不同物种、不同组织的cDNA总量少，易筛构建cDNA文库、筛选目cDNA第二链的合重组DNA分cDNA文筛选目（核酸杂交法、免

mRNA的分离纯化用oligodT)-纤维素柱分离mRNA构建cDNA双链双链

——三种分离mRNA的方1、传统的分离方场下分离mRNA3、梯度离心用蔗糖梯度离mRNA核糖体复合体（溶解细胞）来分离mRNA。高质量mRNA原料

引物oligo- AAA(A)n引物

TTTT12~18 AAA(A)n

cDNA(1)自身引导关键：单链cDNA的３’端能够形发夹结碱水解

TTTT12~185’AAA(A)nTTTT12~18

TTTT12~18Klenow酶、TTTT12~18AAAA12~18S1核酸

AAAA12~18 双链 RNA

TTTT12~185’AAA(A)nTTTT12~18

KlenowT4DNA连接酶

构建cDNA文库细胞破碎，除去DNA和蛋白oligo(dT)纤维素亲纯化反转

mRNA合成 插入载导入受体细

组DNA组DNA文（三）PCR方 目 接 DNA进行RT-PCR（mRNA-cDNA-（四）人工合成目要求：已知目 的核苷酸序长度受限（1001、按实验目的选择

组文cDNA文

噬菌体载DNA测DNA克表达蛋白

表达型载 ：DNA提3、载体的酶 （体外重组连接反应的类粘性末端的连1、全同源粘性末人工接头连（一）粘性末端1、全同源粘性末 割，并产生配伍粘性末端同

BamH 切G 载体DNA用BamHⅠ切G G

目的DNA用BamHGG

CCTACCTA

目 自 OH3’ 正向插 反向插缺点、 ——载体自我环、目的片段双向插入:增加筛选的工作鉴定插入与非插入的重组子 方法：载体片断去磷酸化，防载体自我环化定义：使外源DN 分子中的克隆方 定向克隆方案：将外源DN 限制性内切酶切割，载 相同的两个内切酶切割（双酶切连接方式（1）粘粘（）粘平（酶切，补平

将粘性末端转变成钝性末OHG

GAATCTTA

CTTA

对5-粘性末端片段，利用大肠杆菌DNA聚合酶I的Ⅰ CTGC G

对3粘性末端的片段，应用如T4DNA聚合酶的3→5的核酸外切酶活性可切去未配对的序列，将其适用于：1有些限制性内切酶切割DNA后，2粘端 点 适应 目的片段双向插T4DNA连接酶 种类：1连接子特点两端平头，含限制酶切位 适子 EcoRⅠ应

CC

Eco优点 利于目的DNA从载体上切（四）同聚物加具有3’-OH的单链末端，可在末端移酶（TdT）DNA3’-OH

限制酶或 剪

A(A)nA

T(T)nTNDN1五、T-A克隆（T-A ：PCR产 ：TaqDNA聚合酶扩增的PCR产物末端有游离的A T-vector两条链的5’-端含有一个游离的PCR过程中 通的Taq酶可在产物3’-端多加一个反应体系：目的载体T4DNA连接连接缓冲液DNA温连接体 粘末端连接：12- DNA载体分子数:目 分子数=1:1- 平端连接时需加大酶连接时构建重组载体产生DNA杂合分重组DNA（重组子或重组体携带有目的DNA的载宿主细胞原核细导入导入细菌/原核细胞，使其获得新的表将外源DNA直接转入真核细胞的过 将DNA（非包装）导入细胞噬菌体载体和细胞载体转移，其重组子导入受体细胞时先需 常用的方 法 感受态

法 感受态细菌（competentcell）： 外源DNA状态的细菌 CaCl2溶液后，细胞 DNA与CaCl2形成羟基-磷 复 感受态细胞+连接反应产物（重组子00C 00C,2min液体培养基，370C将细 于固体培养基370C,Transformation petentCaCl2 磷 聚糖转染技外源DNA导入真核细

导 转移 穿DNA化学方 磷 导 转1、磷酸 Calciumphosphateco- 外源DNA或重组质粒与磷 形成DNA—磷酸复合物，加入到宿主细胞培养基中，颗粒积到于细胞表，部分宿主细胞取这些颗粒将DNA导入细胞。稳定转染效率 过2、 的受体细胞和外源DNA共同置特定的 以 出

点：转化效率高（109-1010/ug3、：由质双分子层组成的封闭，可将DNA包在 小中，与细胞膜合，DNA被放到细胞质中，使多聚阳离子LipofectamineTMReagent（Invitrogen）组成是带正的类DOTMA与原聚阳离子与DNA速形成质体/DNA阳离子复合物，与带的细胞膜合，使DNA进入细胞。效率高于磷酸法和DEAE-用

4、显微注射 需 动

表达方时转染（transienttransfection）： DNA外存在，12小时之内即可表达， 解，并从宿主细胞中失。稳定转染（stable 遗传学筛选方（表型变化酶切鉴PCR鉴

-互补筛选 (marker核酸杂交

原位杂Southern

筛选菌的方法互补筛选标志Ampr（ampicillinresistanse）： Tetr（tetracyclineresistanse）

的蛋白产物(399AAs) 存活，故可进 的筛选。含抗菌素的平抗抗药性入标失记选择() 在)2、蓝白斑筛选—— X- 蓝 产

--D-半乳糖D-半乳糖苷 导 有些克隆载体，含LacZN端146 -半乳糖苷酶的片断突变型lac-E.coli可表 -半乳糖苷酶的片 存在的和片 才具-半乳糖苷酶活性，可使底物（X-gal）变为

X-蓝单 扩大培养提取DNA酶切鉴双酶MW鉴(片断大小鉴定

（三）PCR鉴 特异性引

根据插入片断设计的引原位杂Southern原位杂 WesternBlotIHC（六）DNA序列测质PCR产质 噬菌

组 PCR产

转 体外包装，转表型筛 酶 鉴定 核酸杂 免疫 扩增与存- 存细DNA实验、（一）药物筛新霉素抗性(geneticin,neo,G418) G418能断细白质的合成，真G-418的培养基中进行培养，即可筛选出（二）TK-细胞突变株筛选转染细嘌呤核苷酸生物合成途 嘧啶核苷酸生物合成途5’-磷酸核糖-1-焦磷酸氨基喋呤

尿嘧啶核苷一磷酸 次黄嘌呤核苷一磷酸（HMP） 胸腺嘧啶核苷一磷酸次黄嘌呤磷 胸腺嘧 核糖转移 核苷激次黄嘌呤核苷 胸腺嘧啶核苷 核苷激酶（thymidinekinase,TK） 的真核细胞能有效 核苷 核苷一磷 氨 酸的 物，能与 还原酶不可逆结合 止FH4的生成， 制 与的

单位的转 氨 是从头合成 养缺陷

乳动物受体细胞(tk-细胞乳动物细胞乳动物受体细胞 缺（tk-），缺乏补 将重组DNA导入此类细胞，可用 的养基进行筛选 （hypoxanthine,H）：dATP和dCTP 合成 的底物 核苷（thymidine,T）

HAT TK缺陷细胞（tk-细胞）在含HAT的培养基中无法进行核苷酸的补合成，同时氨基断了从头合成途，使细胞无将含有tk的重组DNA导入tk-细胞，载体上的标记tk能与之遗传互补，细胞在HAT