探讨微生态制剂对断奶仔兔肠道免疫功能的作用,畜牧兽医论文

探讨微生态制剂对断奶仔兔肠道免疫功能的作用,畜牧兽医论文断奶仔兔的生长发育尚未完全,抵抗外界环境的调节机能较差,容易产生腹泻、腹胀和球虫等疾病,降低了日增重和饲料报酬,发病率和死亡率增加.饲养者往往通过添加抗生从来加强仔兔的抗病力,而抗生素在预防和治疗家兔疾病上的滥用现象,经常引起细菌耐药性的产生和肠道菌群紊乱,造成二次感染.微生态制剂以其无污染、无残留、安全可靠、不产生抗药性等优点广泛应用于畜牧业.研究者发现,饲喂微生态制剂能够调节仔鹅盲肠微生态菌群,提高机体免疫力和生长性能,同时加强断奶仔兔的抗病力,降低料肉比,减少腹泻率,提高断奶仔兔的生产性能.1997年变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)首次应用于微生物生态学研究,并证实该技术在研究自然界微生物群落遗传多样性和种群差异方面具有显着优越性.在畜牧业养殖中,DGGE逐步应用于牛、羊、猪和鸡等动物肠道菌群多态性和系统发育关系的研究,在兔肠道的研究中应用还较少.白秀娟等(2020)研究结果表示清楚,PCR-DGGE完全能够用于断奶后仔兔肠道菌群构造的研究,进而弥补了传统微生物分离培养方式方法费时费力和精到准确度差的缺陷.本文旨在通过测定添加微生态制剂后回肠SIgA的分泌量,讨论微生态制剂对断奶仔兔肠道免疫功能的作用,并从分子水平讨论肠道菌群的变化,为其在畜牧业中应用提供参考.1材料与方式方法1.1材料肽菌素:购自山东宝来利来生物工程股份有限公司,主要由高活性抑菌型枯草芽孢杆菌、乳酸菌及其代谢产物抗菌肽组成,活菌总数1.5108cfu/g.常康泰:购自山东宝来利来生物工程股份有限公司,主要由高效抑菌型芽孢杆菌、乳酸菌、细菌素、抗菌肽及肠道修复因子组成,活菌总数3.0108cfu/g.布恩氏固定液、苏木精和伊红染色液:由山东宝来利来生物工程股份有限公司生物研究院实验室自制.SIgA检测试剂盒:购自普天试剂公司.粪便基因组提取试剂、PCR扩增试剂:购自TIANGEN公司.实验设备:切片机、酶标仪、PCR仪、DGGE电泳仪(Bio-Rad)、脱色摇床.1.2试验设计与日粮组成试验采用单因子完全随机区组设计,选用刚断奶仔兔120只,平均体重为513g.随机分为4组,每组3个重复,每个重复10只兔.对照组饲喂基础日粮(参考正常兔料营养标准),试验1~3组分别在基础日粮的基础上添加肽菌素(120g/t)、复合肽菌素(120g/t)和锌酵母(150g/t)以及常康泰(500g/t).基础日粮根据当地肉兔的营养水平配制,日粮组成及营养水平见表1.1.3饲养管理断奶仔兔采用笼养方式,每笼2~3只.试验期间仅提供颗粒料,不饲喂其他精青粗饲料.天天早晚定时喂料,自由采食、饮水.搞好兔舍卫生工作,保证兔舍暖和、枯燥、清洁,统一免疫和驱虫.1.4样品采集试验期结束后,将各组兔处死后解剖,取一段回肠,冲洗干净后于10%的福尔马林溶液中固定用于观察小肠绒毛,另取一段回肠(连同内容物)-80℃保存,用于测定SIgA的表示出量,最后取盲肠内容物,将每组每个重复内10只兔的盲肠粪便做等份混合,即每个组有3个盲肠粪便样品,再将这3个样品做等份混合构成第4个样品,即每组有4个样品用于检测微生物菌群的变化.1.5测定指标及方式方法1.5.1兔回肠绒毛观察截取一小段兔回肠包埋在石蜡中,使用切片机横向切片后脱蜡,布恩氏固定液固定5min后乙醇洗涤,苏木精、伊红染色各30min,最后用加拿大树胶封片.置45℃温箱中烘烤过夜后进行镜检.1.5.2兔回肠SIgA抗体水平的测定准确截取1cm肠段,用剪刀纵向剖开.参加5mLPBS缓冲液,漩涡震荡1min.8000r/min离心5min,取上清液,移入新的离心管.取的上清液12000r/min离心10min后取上清液为待测样品,用ELISA试剂盒检测.1.5.3兔肠道菌群构造的变化每个试验组称取粪便样本180~220mg至干净的2mL离心管,离心管置于冰盒上.根据粪便基因组提取试剂盒讲明书的步骤提取兔粪便总DNA.以提取的DNA直接作为PCR模板,采用细菌16SrRNA基因V3区通用引物对:GC-357F(5-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3)和517R(5-ATTACCGCGGCTGCTGG-3),引物由上海生工合成.PCR反响体系25L:2Taqmix12.5L,上、下游引物(10umol/L)各1L,模板DNA1L,无菌双蒸水9.5L.PCR反响程序为:94℃预变性4min;94℃变性1min,65℃退火45s,退火温度每个循环降低0.5℃,当退火温度降至55℃后,再以该温度扩增15个循环;最后72℃延伸8min.PCR产物用1%的琼脂糖凝胶(EB染色)紫外下进行检测.配制变性梯度为30%~70%的DGGE胶,电泳时参加10L的样品和少许loadingbuffer,打开电泳仪,设置电压为80V,时间为668min.电泳结束后,进行硝酸银染色,显影.相机拍照后采用FastStoneCapture软件进行截图,使用QuantityOne软件(Bio-Rad)对DGGE指纹图谱进行丰富度分析和聚类分析.用无菌手术刀将DGGE图谱中部分优势明显、条带清楚明晰且亮度高的特异性条带从凝胶上切下,参加40L去离子无菌水,将胶块捣碎,4℃过夜.取液体做模板进行PCR扩增,引物为去掉GC夹的GC-357F和517R,PCR体系和条件同上.扩增产物大小在161-201bp,送上海铂尚生物技术有限公司测序,得到的测序结果和NCBI中GenBank数据库中BLAST比对分析.1.5.4数据处理数据先使用MicrosoftExcel整理,再通过统计软件SPSS11.5.0进行单因素方差分析(One-wayAnova),用LSD法比拟分析差异,显着标准为P0.05,结果以直方图或者平均数标准误差表示.2结果与分析2.1兔回肠HE染色结果由图1可知,相对于对照组,三个试验组的小肠绒毛高度明显上升,隐窝变深,吸收营养物质的有效面积明显增大.从形态上看,对照组小肠绒毛形态呈现叶状,试验1组小肠绒毛为舌状,试验2组和3组的小肠绒毛形态为指状.2.2兔回肠SIgA检测结果由表2能够看出,与对照组比,试验1组、3组兔回肠SIgA表示出无显着变化,而试验2组SIgA表示出量显着增加.讲明试验2组微生态制剂的添加能够提高断奶仔兔的免疫力,加强机体的抗病能力.2.3兔肠道菌群构造的变化2.3.1PCR扩增结果16srDNA的扩增产物经琼脂糖电泳后结果如此图2所示,每个泳道只要1条亮带,未产生非特异性条带,基因扩增片段大小均在161~201bp,参考DNAmarker可看出各目的基因的片断大小与设计相符,表示清楚所扩增片段为特异性目的片段.2.3.2DGGE指纹图谱分析各样品DGGE图谱如此图3所示.每一泳道代表一个样品,每个泳道内的条带代表一种细菌,条带的亮度代表该菌的相对丰度.丰富度(S)为DGGE图谱中每一泳道的条带数.如表3所示,盲肠内的菌种数接近30种,而相对于对照组,试验各组无明显差异性.2.3.3聚类分析由图4能够看出1、2、3、4的菌群类似性均在0.53以上,华而不实2、3样品的类似性为0.81;5、6、7的类似性在0.83以上;9、10、11、12样品的类似性在0.58以上;13、14、15的类似性也在0.48以上,讲明组内各样品之间的微生物菌落差异不大,动物建模较为成功.同时,能够看出对照组和试验一组的样品之间类似性在0.53以上,对照组、试验1组、2组与试验3组的类似性也在0.48以上,讲明这三个组微生物菌群变化不大;而对照组、试验1组、试验3组与试验2组的类似性则只要0.39,讲明试验2组的处理导致了仔兔肠道菌群的明显变化.2.3.416SrDNA序列测序结果图2黑框内的条带分别为试验2组和试验3组中亮度较高的差异条带,选取该条带割胶测序.测序结果表示清楚,试验2组差异菌种与Bifidobacteriumanimalis亲缘关系近期,类似性为99%,为动物双歧杆菌菌属;试验3组差异菌种与Lactobacillusplantarum,类似性为99%,为植物乳酸菌菌属.3讨论DGGE是由Fisher等发明用于检测DNA突变的一种电泳系统,它是利用序列不同的DNA片段在聚丙烯酰胺凝胶中解链温度不同的原理,通过梯度变性胶将DNA分开(FISCHERS等,1983).与其它电泳系统相比,它不是基于核酸分子量的不同将DNA片段分开,而是根据序列的不同,将片段大小一样的DNA序列分开.理论上以为,只要电泳条件(如电泳时间、变性剂梯度、电压等)精到准确控制,DNA片段可分辨到一个碱基的差异.利用DGGE指纹图谱分析微生物菌群,具有快速精到准确、无需培养、检测度高的优势.本研究结果讲明,微生态制剂能够促进仔兔小肠绒毛高度的上升和隐窝的加深,扩大营养物质吸收面积,提高饲料报酬.以往研究也发现,在断奶应激情况下,饲料中添加微生态制剂可提高仔兔的生产性能和免疫功能,维护断奶仔兔肠道菌群平衡和促进肠道发育,这与本次试验结论相一致.SIgA存在于不同组织的粘膜上,在构造上比IgA多一条氨基链,由局部粘膜自行合成,不受血清中抗体调节,回肠中含有大量的浆细胞能够分泌SIgA,它能够与抗原发生结合反响,进而阻止肠道粘膜外来微生物的定植,抵抗病原菌的感染.锌酵母和肽菌素的联合使用能够提高兔回肠SIgA水平,加强兔肠道对病菌的抵抗力.丰富度分析讲明兔盲肠内微生物种群丰富,菌种接近30种,而添加微生态制剂后不会引起盲肠内微生物群落的急剧改变,在一定程度上有效地保持了兔盲肠内的微生态平衡.以往研究发现,猪和鸡不同个体的肠道内容物菌群构造有很大差异,研究者经常将同一处理组的样本进行混合来减少平行样本间的差异性.为减少组内样本之间的差异性,该实验将每组的3个样本进行了等量混合,构成第4个样本,聚类分析讲明组内样本差异性较小,保证了数据的可用性.结果显示,基础日粮中单独添加肽菌素或者添加常康泰不能有效地改变兔盲肠内的菌群构造,而将锌酵母和肽菌素联合组方后,兔回肠SIgA水平显着上升,盲肠内的菌群构造发生了较大的变化.锌是兔生长所必需的一种微量元素,是体内多种酶的重要组成成分.梅绍锋等(2018)指出锌的添加能提高胃蛋白酶和胰淀粉酶活性,降低盲肠大肠杆菌、乳酸杆菌和双歧杆菌数量;张之申等(1992)发现锌酵母的添加能够促进锌在家兔体内的吸收,提高断奶仔兔的免疫力和成活率.因而,能够推断锌酵母的添加能够协同肽菌素提高断奶仔兔的肠道免疫水平,改善肠道菌群构造.测序结果证明,基础日粮中添加锌酵母和肽菌素组方或者添加常康泰分别增加了乳双歧杆菌和植物乳酸菌的比例,张振瑞等(2007)通过鉴定健康家兔肠道内的益生菌,发现肠道内优势菌群包括梭杆菌属、双歧杆菌属、乳杆菌属、明串球菌属、拟杆菌属,与本次研究结果相一致.因而,基础日粮中添加锌酵母和肽菌素组方或者常康泰能够促进断奶仔兔小肠的粘膜免疫,提高盲肠内有益菌群的优势度,进而有效地抑制有害菌的发生和繁衍.以下为参考文献:[1]赵泮峰,任战军,王洪阳.早期断乳幼兔腹泻内因分析[J].饲料工业,2018,31(23):52-54[2]PAKANDLM.Coccidiaofrabbit:areview[J].FOLIAPARASITOLOGICA,2018,56(3):153-166.[3]董巍,张玉杰,林丰海,等.微生态制剂对黑龙江仔鹅盲肠菌群变化的影响研究[J].中国畜牧兽医,2007,34(8):20-22.[4]李振.微生态制剂对断奶仔兔生产性能及免疫的影响[J].中国微生态学杂志,2018,21(8):718-720.[5]GIDERMET,JEHLN,SEGURAM,etal.Microbialactivityinthecaecumoftherabbitaroundweaning:impactofadietaryfiberdeficiencyandofintakelevel[J].AnimalFeedScien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