原核基因表达及其调控

原核基因表达及其调控第一页，共八十六页，2022年，8月28日要注意的关键名词术语:1)编码链（有义链，thecodingstrand）;6)转录单位（Atranscriptionunit）;2)反义链（模板链，thetemplatestrand）;7)上游（Upstream）;3)RNA聚合酶（RNApolymerase）;8)下游（Downstream）;4)启动子（Apromoter）;9)转录起始位点

(Startsite);5)终止子（Aterminator）;10)初始转录产物Aprimarytranscript新生RNA序列与模板链互补；与编码链相同。第二页，共八十六页，2022年，8月28日第三页，共八十六页，2022年，8月28日RNA聚合酶可形成1个中间管道第四页，共八十六页，2022年，8月28日第五页，共八十六页，2022年，8月28日(二)、原核生物基因的翻译第六页，共八十六页，2022年，8月28日起始因子Initiationfactors(IFs)可稳定自由状态的30S亚基；以及结合起始tRNA到30S-mRNA复合物上

第七页，共八十六页，2022年，8月28日第八页，共八十六页，2022年，8月28日第九页，共八十六页，2022年，8月28日

E.coli用作受体菌的优势：

（1）对其遗传学背景、分子生物学、生物化学和生理学方面的了解较为深入；（2）很多目的基因能在E.coli中迅速而有效地表达；（3）其培养条件易于掌控，培养费用相对较低。。第十页，共八十六页，2022年，8月28日第十一页，共八十六页，2022年，8月28日

非调控启动子：对细胞产生伤害

(1)持续性地高水平表达某一目的基因会过分消耗宿主细胞的营养和能源，最终造成致死效应;(2)由于使宿主细胞处于生长的逆境，容易发生载体质粒的丢失；(3)非调控性地表达外源蛋白，容易受到蛋白酶的水解作用，从而使最终的蛋白量并不高；(4)形成不溶性的包含体蛋白。第十二页，共八十六页，2022年，8月28日第十三页，共八十六页，2022年，8月28日可调控启动子的特征：

（1）通过与阻遏蛋白的相互作用，提供一个开关系统，使启动子能在特定条件下发生关闭或者开放；（2）容易被大肠杆菌的RNA聚合酶全酶所识别。第十四页，共八十六页，2022年，8月28日四种简单类型控制通路

诱导作用是指存在诱导物能使阻遏蛋白失活，或者可激活一个激活蛋白而解除阻遏蛋白对转录起始过程的阻遏；阻遏作用是指一个辅阻遏物激活一种阻遏蛋白，或者使一种激活蛋白失活而对转录过程发生阻遏作用。第十五页，共八十六页，2022年，8月28日lac启动子：（1）lac启动子来源于大肠杆菌的乳糖操纵子，包括启动子、活化蛋白（cataboliteactivatorprotein,CAP）结合位点、操纵基因和lacZ组成。（2）lac启动子受到阻遏蛋白（repressor）的负调控，而受到CAP和cAMP的正调控。其中CAP的正调控是通过增加启动子与RNA聚合酶的亲和性而起作用。(3)lac启动子由于与阻遏蛋白相结合而处于关闭状态，但当加入乳糖或者半乳糖苷结构类似物，如异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、硫甲基半乳糖苷（TMG）和邻硝基苯基半乳糖苷（ONTG）后可发生脱阻遏作用。第十六页，共八十六页，2022年，8月28日乳糖操纵子基因产物:1)lacI:阻遏蛋白;

2)lacZ：-半乳糖苷酶；3)lacY：透性酶;4)lacA：硫代半乳糖苷转乙酰基酶第十七页，共八十六页，2022年，8月28日cAMP参与乳糖操纵子的调控：（1）cAMP通过与cAMP受体蛋白（CRP）结合，引起CRP构象变化，形成一种有活性的cAMP-CRP复合物；（2）乳糖操纵子启动基因（O）有2个位点：一个与RNA聚合酶结合；另一个与cAMP-CRP结合，而且只有后者结合后才能与启动基因结合，启动转录过程；（3）cAMP-CRP复合物不仅可以与一个启动基因结合，而且还可以与几个操纵子上的启动基因结合，从而影响到许多操纵子。第十八页，共八十六页，2022年，8月28日GlucosereducesCRPactiviyCRP复合物形成促进RNA聚合酶与启动子的结合当CAP与cAMP协同作用时，其对启动子的亲和性发生增强，而此时如果葡萄糖的量达到最低时，其亲和性最高。这样，当诱导物存在时，高浓度的cAMP水平能够导致乳糖操纵子的启动子发生高水平的转录作用。细胞中的葡萄糖浓度调控cAMP-CRP结合活性第十九页，共八十六页，2022年，8月28日trppromoter色氨酸启动子

由色氨酸阻遏蛋白进行调控：正调控作用。可形成启动子-阻遏蛋白复合物。

trp启动子的脱阻遏可通过：

（1）移除色氨酸；（2）加入色氨酸结构类似物，如吲哚丙烯酸（3-indoleacrylicacid）.3’--吲哚丙烯酸第二十页，共八十六页，2022年，8月28日trpR阻遏蛋白Trp第二十一页，共八十六页，2022年，8月28日

色氨酸操纵子（trpoperon）由启动子、衰减子、操纵基因和色氨酸合成的5种酶组成。

（1）由trpR产生的阻遏蛋白只有在与色氨酸结合后才能形成有活性的阻遏蛋白，它可以与操纵基因结合从而阻止转录的起始。当色氨酸缺乏时，该阻遏蛋白的前体不能与操纵基因结合，也就不能发挥阻遏作用，此时转录可起始；（2）当细胞中的色氨酸浓度较高时，在衰减子的作用下，操纵子DNA形成类似终止子的茎环结构，从而只能翻译出14肽，称为前导肽。IAA是色氨酸的结构竞争类似物，它可以与阻遏蛋白结合而使其失去阻遏活性；不能再与操纵基因结合，从而不能阻遏转录过程。

第二十二页，共八十六页，2022年，8月28日第二十三页，共八十六页，2022年，8月28日Ptac启动子：

是来自于lac和trp的一组杂合启动子，但是比lac和trp都强得多，是一组强启动子。包括：（1）PtacI：PlacUV5的-10区＋Ptrp的-35区；（2）PtacII：Ptrp的-35区（一段合成的包括Pribnow框在内的46bp的DNA）＋Plac的操纵基因；（3）Ptac12：Plac的-10区＋Ptrp的-35区

所有Ptac都受IPTG的诱导，同时受到阻遏蛋白的阻遏调控。

第二十四页，共八十六页，2022年，8月28日PL启动子：

阻遏蛋白:cI，来源于噬菌体.

cI857

:为cI温度敏感突变体.(1)将携带敏感的cI857

的细菌细胞首先在28to30C条件下

培养，此时cI857

阻遏PL启动子的转录；(2)当细菌细胞被培养至特定浓度时（一般是到达平衡期），将培养温度升高至42C,此时cI857

不再发生阻遏作用，PL启动子开始启动转录过程。

第二十五页，共八十六页，2022年，8月28日

PL为噬菌体左向早期启动子，控制基因从N到att的早期转录，受到cI所编码的阻遏蛋白的调控。噬菌体左向操纵子结构示意图PL启动子第二十六页，共八十六页，2022年，8月28日第二十七页，共八十六页，2022年，8月28日优良表达载体的性能（1）强转录启动子和终止子；（2）核糖体结合位点（RBS）的强弱；（3）质粒载体及其质粒的拷贝数；是否整合到染色体DNA之上；（4）合成的外源蛋白在细胞中的定位；（5）宿主的翻译效率；（6）克隆载体所表达的外源蛋白的稳定性。第二十八页，共八十六页，2022年，8月28日

1、含lac启动子的表达载体：

多种。其最大的特点是带有编码lacZ（-半乳糖苷酶）的编码序列。当外源基因插入后，如果能够保持正确的ORF，就可以形成由外源基因编码的多肽和-半乳糖苷酶组成的融合蛋白。所有含lac启动子的表达载体都受到IPTG的诱导。第二十九页，共八十六页，2022年，8月28日

pOP203-13特点（1）为pBR322衍生质粒，插入了强启动子PlacUV5并在其下游加入了-半乳糖苷酶的编码序列（-gal）21bp片断和一个EcoRI位点；（2）其融合蛋白的N端为-半乳糖苷酶的前7个氨基酸和

EcoRI接头编码的少数几个氨基酸，其C端为完整的外源蛋白。pOP203系列表达载体：AfamilyofcloningvectorscontainingthelacUV5PromoterpOP203-1,2,3、pOP203-13、pOP203-24、pOP203-27、pOP203-28、pOP203-29表达载体pOP203质粒结构示意图第三十页，共八十六页，2022年，8月28日

2、含trp启动子的表达载体：（1）产生的表达蛋白的量高于lac启动子；（2）所有含trp启动子的表达载体都受到3--吲哚丙烯酸（IAA）的诱导。如：pDR720第三十一页，共八十六页，2022年，8月28日

质粒pDR720是一个含trp启动子的表达载体，它来源于p51，trp启动子在SmaI位点插入，在启动子的下游有3个位点，SalI、BamHI和SmaI，可以插入外源基因。质粒载体pDR720结构示意图第三十二页，共八十六页，2022年，8月28日

3、含tac启动子的表达载体：

高表达效率启动子；受IPTG的诱导。多种商业化的载体。如：pKK223-3;pBADHis-A,B,C;pTrcHis-A,B,C;pSE420

第三十三页，共八十六页，2022年，8月28日特点：1）Ampr；2）tac启动子；3）lacZ核糖体结合部位；4）ATG起始密码子，位于RBS下游8bp处；5）来源于-噬菌体的终止子T1和T2，以避免其它基因的过度转录。第三十四页，共八十六页，2022年，8月28日第三十五页，共八十六页，2022年，8月28日第三十六页，共八十六页，2022年，8月28日第三十七页，共八十六页，2022年，8月28日

4、含PL启动子的表达载体：是一种极强的启动子，所以被广泛用于各种载体的构建；如：pPL-;（1）来源于pBR322,pBR322的EcoRI/BamHI位点被PL和N基因取代；（2）外源基因可以插入到N基因中的HpaI位点；（3）当培养温度为29-31C时，PL启动子处于阻遏状态；但当温度升到42C，发生脱阻遏。第三十八页，共八十六页，2022年，8月28日质粒载体pPL-结构示意图第三十九页，共八十六页，2022年，8月28日（三）提高蛋白质的表达量某些表达载体被构建用于增加蛋白质的表达量，例如，pPLc2833

:（1）强启动子；（2）选择性标记；（3）多克隆位点（MCS）其衍生质粒pCP3的构建：将pPLc2833的复制起始位点替换为另一个质粒pKN402。质粒pKN402的复制起始位点是耐温型的，在42C时仍然有很强的复制起始的功能。第四十页，共八十六页，2022年，8月28日电泳后回收片段c电泳后回收片段1和3连接第四十一页，共八十六页，2022年，8月28日

由于pKN402和pCP3的复制子在42C时仍然具有很强的起始复制能力，因此当培养温度升高到42C时，细胞中的pKN402和pCP3的拷贝数要比pPLc2833高5～10倍。温度对3种表达载体质粒拷贝数的影响第四十二页，共八十六页，2022年，8月28日（四）大规模培养系统

小规模培养（1～5L）含表达载体的重组菌株时，其调控可以直接向培养基中添加诱导物，或者升高温度，但是在半工业化（20～200L）或者工业化大规模（大于200L）生产时，不能采用小规模的方法：（1）直接向培养基中添加诱导物如IPTG，由于需要量较大，成本高，不经济；（2）即使是使用温度敏感的表达载体，升高温度既需要较长的时间，又需要很大的能源消耗，成本也很高。一种解决的途径：使用“双质粒系统”：用trp启动子带动编码cI阻遏蛋白的基因，然后将它们置于一个弱启动子的载体上；将要表达的外源基因置于强启动子PL之下，使其受PL启动子的控制。第四十三页，共八十六页，2022年，8月28日“双载体系统”特点：1）当培养基中Trp含量较低时，trp启动子启动，cI阻遏蛋白合成，此时PL启动子受阻遏，目的基因不表达；2）添加Trp（可添加蛋白胨）以后，trp启动子受阻遏，而PL启动子启动，此时可表达外源蛋白。A培养基中不存在色氨酸B培养基中存在色氨酸cI蛋白合成（脱阻遏）无克隆基因蛋白合成（阻遏）克隆基因蛋白合成（脱阻遏）cI蛋白不合成（阻遏）第四十四页，共八十六页，2022年，8月28日（五）在其它微生物中的表达

除了E.coli以外，有些微生物也可以用作表达外源蛋白的宿主菌（受体菌）。

-半乳糖苷酶在不同受体菌中的表达：

苜蓿根瘤菌豌豆根瘤菌恶臭假单胞菌大肠杆菌第四十五页，共八十六页，2022年，8月28日

-半乳糖苷酶在不同受体菌中的表达分析：(1)所有启动子在受体菌中都有一定的活性；(2)tac启动子在大肠杆菌中活性最高，但是在其它受体菌中活性最低；(3)新霉素基因启动子（Nm）是在大肠杆菌中活性最低的启动子，但是在其它受体菌中驱动转录的活性却最高。第四十六页，共八十六页，2022年，8月28日第四十七页，共八十六页，2022年，8月28日

该载体含有四环素抗性基因(Tetr),1个BglII酶切位点，质粒复制子，启动子和1个多克隆位点（amultiplecloningsequence，MCS)。广宿主载体第四十八页，共八十六页，2022年，8月28日（六）非融合蛋白的表达

指所表达的外源蛋白的N-末端不含有其它任何氨基酸，因此要求其翻译起始位点ATG必须要位于其基因的5’端。表达非融合蛋白，一般要求其编码基因的ATG起始位点与核糖体结合位点（RBS）之间的距离要合适，否则即使仅相差2~3个bp，表达效率也会大受影响。RBS－ATG最适距离的筛选：（1）在ATG上游约100bp处寻找1个酶切位点，进行酶切；（2）再用核酸外切酶III（ExoIII）从该酶切位点开始，部分消化以上酶切片断，得到不同长度的消化片断；（3）将各消化片断与含有启动子序列和RBS序列的载体连接，构建成系列可表达的重组基因，导入受体菌进行表达量分析，从中筛选到最适的RBS-ATG距离。（4）构建融合蛋白。

第四十九页，共八十六页，2022年，8月28日第五十页，共八十六页，2022年，8月28日

表达非融合蛋白的优势：

单基因产物，不受其它蛋白质成分的干扰，有利于其展现完整功能和保持活性。

不利方面：容易受到受体菌蛋白酶的降解，产量较低。

克服的方法：（1）用蛋白酶活性低的菌株作为受体菌。如枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）蛋白酶活性强，而且具有外分泌性，但短芽孢杆菌（Bacillusbrevis）的蛋白酶活性就低得多；（2）用黄嘌呤营养缺陷型菌株（Ion－）作为受体菌。Ion为E.coli合成蛋白酶的主要底物。（3）用蛋白酶抑制剂。如T4噬菌体的pin基因产物。可以将pin同时克隆到质粒载体上。第五十一页，共八十六页，2022年，8月28日（七）融合蛋白的表达及纯化

指所表达的外源蛋白与一种宿主蛋白共价连接，构成融合蛋白。

1、融合蛋白的表达1.“三夹板”式融合2.3.C-末端融合N-末端融合运载蛋白运载蛋白异源功能蛋白运载蛋白运载蛋白异源功能蛋白异源功能蛋白第五十二页，共八十六页，2022年，8月28日通过在细胞膜跨膜蛋白中“镶嵌”外源蛋白，是一种典型的“三夹板”式融合方式第五十三页，共八十六页，2022年，8月28日

pPC系列载体：pPC∆Z1，pPC∆Z2和pPC∆Z3。彼此相差一个碱基。

第五十四页，共八十六页，2022年，8月28日1、pPC载体组中每一个载体

lacZ启动子、SD序列和lacZ

基因的前8个氨基酸编码序列，在lacZ的下游有1个

EcoRI位点；2、pPC∆Z1的EcoRI位点保持不变，其末端为-G;3、pPC∆Z2的EcoRI位点之前多了2个G，经EcoRI酶切后的为-GGG；4、pPC∆Z3的EcoRI位点之前多了4个G，经EcoRI酶切后的为-GGGGG。第五十五页，共八十六页，2022年，8月28日第五十六页，共八十六页，2022年，8月28日

2、融合蛋白的纯化将融合蛋白分割成宿主蛋白和外源蛋白的策略：（1）在融合蛋白和宿主蛋白之间加入一段可被蛋白酶识别的氨基酸序列，如Ile-Glu-Gly-Arg可被溶血因子X识别并在C端切开，并且这一段序列在自然状态下很少出现，因此可以用于分割融合蛋白；

第五十七页，共八十六页，2022年，8月28日

（2）在胰岛素中没有Met，因此在基因工程胰岛素和宿主蛋白之间可以加入一个Met，而表达的融合蛋白的Met在体外可以被CNBr转移性识别和切割，从而形成2条多肽链，1条是胰岛素，另1条是宿主多肽。经过进一步的提纯，就可以得到完整的胰岛素。第五十八页，共八十六页，2022年，8月28日3、融合蛋白的应用（1）在大多数情况下，融合蛋白本身就是很好的终产物，无需处理，如可以用融合蛋白来制备抗体；（2）由于融合蛋白的某些功能单元，可以用于简化提纯步骤。现已开发大量的表达融合蛋白的商业性载体：如Invitrogen公司：细菌表达系统：pBADHis系列、pTrcHis系列等，酵母菌表达系统：pPIC3.5K、pPIC9K等多种。第五十九页，共八十六页，2022年，8月28日第六十页，共八十六页，2022年，8月28日第六十一页，共八十六页，2022年，8月28日第六十二页，共八十六页，2022年，8月28日（八）单一方向串连排列的基因

在低拷贝质粒中表达多个串连排列的基因，以增加蛋白的表达量。限制性内切酶AvaI的应用：表达多个串连基因的表达载体的构建

AvaI第六十三页，共八十六页，2022年，8月28日

单一方向串连排列基因构建方法：（1）先把含CTCGGG序列的质粒用AvaI切开，用DNA聚合酶I补平，两端与EcoRI接头连接，外源基因的起始和终止子都可以通过EcoRI位点克隆到载体上；（2）然后把这个重组片断再用AvaI切出，切出的DNA片断两端的粘性末端不同，因此连接时只能有一个方向；（3）由于插入外源基因使用的是单一的EcoRI位点，因此基因插入的方向有2个，其中只能有一个能够表达。第六十四页，共八十六页，2022年，8月28日第六十五页，共八十六页，2022年，8月28日（九）增强蛋白质的稳定性

构建和表达长半衰期的外源蛋白。正常情况下蛋白质的半衰期：从几分钟到几小时不等。决定于：（1）二硫键形成情况。二硫键可以增强蛋白质的半衰期；（2）所表达的蛋白质的N端是否有特定的氨基酸。一般可以通过在N端增加1个或几个氨基酸，来使蛋白质的半衰期延长。如：在-半乳糖苷酶的N端加上不同的氨基酸，体外存活的时间可以从2分钟到20小时不等。（3）在可能的情况下，改变蛋白质中的“PEST”序列，但这种改变不能影响蛋白质的功能。

PEST序列：即存在于蛋白质分子内部的Pro（P）、Glu（E）、Ser（S）和Thr（T），由于在它们的两端往往存在带正电的氨基酸残基，极易受到蛋白酶的攻击。

第六十六页，共八十六页，2022年，8月28日第六十七页，共八十六页，2022年，8月28日（十）将外源基因整合入染色体上

（1）相对稳定地存在，没有选择压力时也可长期保存；（2）外源基因的整合位点不能位于对宿主菌特别重要的基因内部；（3）一般整合到染色体上的目的基因最好也是由可调控的启动子进行调控。外源基因的整合途径：（1）转座作用（包括插入序列）；（2）同源交换。

第六十八页，共八十六页，2022年，8月28日A、双交换的发生：仅目的基因整合到染色体上B、单交换：整个质粒整合到染色体上第六十九页，共八十六页，2022年，8月28日使用Marker可以很方便地筛选整合重组菌株第七十页，共八十六页，2022年，8月28日-淀粉酶基因整合到染色体上的拷贝数与未发生整合但由多拷贝质粒携带时表达活性的比较第七十一页，共八十六页，2022年，8月28日第七十二页，共八十六页，2022年，8月28日（十一）外源蛋白的分泌分泌途径：（1）分泌到周质区（周质空间）；（2）完全分泌到细胞外的培养基中。大肠杆菌蛋白的途径：（1）N端有分泌信号的蛋白：信号肽以及一组以Sec命名的蛋白：SecA、B、D、E、F和Y等，一般仅分泌到周质空间。（2）C端有分泌信号的蛋白：-溶血素（-hemolysin）:可完全分泌到培养基中。第七十三页，共八十六页，2022年，8月28日第七十四页，共八十六页，2022年，8月28日第七十五页，共八十六页，2022年，8月28日第七十六页，共八十六页，2022年，8月28日（一）包含体蛋白的提取包含体蛋白：Inclusionbody在大肠杆菌中当外源蛋白的表达量达到20％时，由于表达部位的低电势和外源蛋白分子的特殊结构（如富含Cys、无糖基化等），使外源蛋白与其周围的其它杂蛋白及其核酸一起形成的一种不溶性的结构。在大肠杆菌中所表达的外援蛋白大部分都是以包含体的形式存在。第二节原核生物表达产物的分离纯化第七十七页，共八十六页，2022年，8月28日

包含体蛋白的提取步骤：

（1）菌体的收获、破碎与包含体的洗涤一般可在5000～10000g下离心收集菌体，然后进行菌体的破碎。菌体常用破碎方法：①物理方法：Sonication/FrenchPressure②化学方法：Lysozyme（溶菌酶）、表面活性剂、强碱（须考虑外源蛋白的耐受性）洗涤目的：去除吸附在包含体表面的不溶性杂蛋白。常用洗涤液：①1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、NP40等；②可以在中性去垢剂中再添加EDTA和二硫苏糖醇（DTT）、巯基乙醇等还原剂，并保持NaCl的浓度为50mM；③低浓度盐酸胍或中性去垢剂、EDTA及还原剂共同使用。加入的洗涤液可以通过柱层析等方法除去。

第七十八页，共八十六页，2022年，8月28日

包含体蛋白的提取步骤：

（1）菌体的收获、破碎与包含体的洗涤一般可在5000～10000g下离心收集菌体，然后进行菌体的破碎。菌体常用破碎方法：①物理方法：Sonication/FrenchPressure②化学方法：Lysozyme（溶菌酶）、表面活性剂、强碱（须考虑外源蛋白的耐受性）洗涤目的：去除吸附在包含体表面的不溶性杂蛋白。常用洗涤液：①1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、NP40等；②可以在中性去垢剂中再添加EDTA和二硫苏糖醇（DTT）、巯基乙醇等还原剂，并保持NaCl的浓度为50mM；③低浓度盐酸胍或中性去垢剂、EDTA及还原剂共同使用。加入的洗涤液可以通过柱层析等方法除去。

第七十九页，共八十六页，2022年，8月28日

（2）包含体的融解包含体是通过疏水作用力、氢键、离子键和二硫键等维持的，融解时必须综合考虑变性剂的浓度、温度、作用时间、溶液离子强度、pH值及其蛋白质浓度与变性剂的比值等多种复杂因素。①SDS：是曾经广泛使用的溶解剂，可以在低浓度（1％）下使包含体溶解。但是结合到外源蛋白上的SDS分子很难除去，这种蛋白作为药物使用的话，可能会造成流产；同时少量氧化物的存在会造成外源蛋白的共价修饰，因此目前很多国家的政府机构，已经禁止用SDS溶解的蛋白产品上市。②尿素和盐酸胍：对包含体的氢键有较强的可逆变性作用。一般人们采用8～10mol/L的尿素溶解包含体，其溶解速度较慢，溶解度为70－90％。在复性后不会造成蛋白质的严重损失，同时还可以选用多种层析方法对提取到的包含体进行纯化。目前，尿素已被广泛用于包含体的溶解。第八十页，共八十六页，2022年，8月28日盐酸胍的溶解效率很高，可以达到95％以上，且溶解速度快，因而不会对外源蛋白进行共价修饰。但是，它的缺点就是成本较高，而且除去盐酸胍会造成较大的蛋白质损失，另外，盐酸胍对于外源蛋白进行进一步的离子交换层析有干扰作用。。一般变性时要考虑以下几方面的因素：

①变性剂的浓度及变化率；②外源蛋白的浓度及其纯度；③氧化还原剂的选择；④pH值的选择；