基因工程的载体

第三章基因工程的载体前言载体通论第一节质粒载体第二节

λ噬菌体载体第三节单链丝状噬菌体载体前言载体通论一、基本概念

利用重组DNA技术分离目的基因，称之为基因克隆(genecloning)。克隆(clone)：作物动词时是指从单一祖先产生同一的DNA分子群体或细胞群体的过程，作名词时指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊群体。基因文库(genelibrary)：由大量的含有基因组DNA的不同DNA片段的克隆所构成的群体。载体(vector)：在基因工程中，携带着目的基因或DNA片段进入宿主细胞进行扩增或表达的工具DNA分子。二、分类

克隆载体表达载体质粒载体噬菌体载体人工染色体按载体功能分按载体性质分表达体系载体宿主原核生物表达体系质粒、噬菌体细菌酵母表达体系大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒酵母转基因植物体系大肠杆菌-农杆菌穿梭载体（Ti质粒）、病毒等植株哺乳细胞表达体系大肠杆菌-农杆菌穿梭载体（病毒）、脂质体等培养动物细胞基因直接导入DNA本身（基因枪微粒轰击法等）生殖细胞、体细胞、个体三、基因工程载体必须具备的条件：

※（1）有复制起点

※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点

※（3）具备合适的筛选标记

※（4）具备合适的拷贝数目（5）分子量要相对较小（6）在细胞内稳定性要高（7）易分离纯化※表示载体必须具备的条件第一节质粒载体一、质粒(plasmid)的基本特性

Plasmid独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。质粒是细菌染色体外能自主复制的环形双链DNA分子。质粒DNA多呈超螺旋的共价闭合环状DNA(covalentlyclosedcircular,cccDNA)，大小为1-200kb，可以持续稳定地处于游离状态，但一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随染色体复制而复制。编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒。质粒DNA在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此应用广泛。1、质粒的复制：由复制子(ori，复制起始区及与此相关的顺式作用元件)决定。质粒复制的机理请见教材。2、质粒的拷贝数：根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200个拷贝）。作为载体的质粒一般应该是松弛型的。拷贝数是由复制起始点的类型决定的，如pMB1或ColE1。

pUC系列载体中的突变型pMB1复制子可达500-700个拷贝。3、质粒的不亲和性(incompatibility)：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。涉及细胞分裂过程中的竞争性选择。不相容群。4、质粒的转移性：自然条件下质粒可通过细菌的接合(conjugation)的作用而转移到新的宿主细胞中。三亲杂交法。质粒载体应具备的条件：1有特定的复制起始子。2有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有1个；3有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验；4有一定容量；5有相当的拷贝数，即每个宿主菌可能容纳的最多数。2023/1/239二、标记基因1、选择标记基因：用于鉴别目的DNA的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。Ampr（氨苄青霉素抗性基因）：水解β-内酰胺环。Tetr（四环素抗性基因）：阻止四环素进入细胞。Cmr（氯霉素抗性基因）：编码氯霉素乙酰转移酶。Kanr（卡那霉素抗性基因）：编码氨基糖苷磷酸转移酶。supF（琥珀突变抑制基因）：编码细菌抑制性tRNA，可翻译UAG为酪氨酸。赭石突变（UAA），乳白突变（UGA）。正向选择标记：蔗糖致死基因sacB。2023/1/23102、筛选标记基因：用于将重组子与非重子区别开来。α-互补(αcomplementation)：人工突变使大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因(lacZ)缺失N-端的第11-41位氨基酸，而载体则携带有LacZ基因的N-端140个氨基酸和编码区段(lacZ’)，二者单独存在时均无功能，但共存于一个大肠杆菌细胞时则发生功能互补，形成具有完全活性的LacZ酶。多克隆位点(multiplecloningsite)：载体上的一段人工设计和人工合成的DNA序列，含有多个在该载体唯一的限制性内切酶的切点，以方便载体与外源片段的重组。插入失活(insretionalinactivation)：当一段足够长的外源DNA片段插入到一个功能基因的编码区后，导致ORF移码或提前终止，严重破坏原基因的编码能力而使该基因失活。蓝白斑筛选(white-bluescreening)：空载体转化子经IPTG诱导表达后，由于α-互补而形成的功能性的LacZ蛋白，能够转化无色底物X-gal而形成深蓝色的产物，使菌落或噬菌斑显蓝色(蓝斑)；重组载体的转化子中，由于lacZ’基因的插入失活而不能形成α-互补，在IPTG+X-gal条件下菌落或噬菌斑不显蓝色(白斑)；通过菌落或噬菌斑的蓝/白色差异而达到筛选鉴定出重组子与非重组子的目的。三、质粒载体的种类质粒的发展阶段

第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101、ColE1、pCR、pBR313和pBR322。

第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。

第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3、T7、SP6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。1、克隆载体1）pBR322

pBR322为4.36kb的环状双链DNA，其碱基序列已经全部清楚。是最早应用于基因工程的载体之一。把pBR322用限制性内切酶切去某片段，换上合用的表达组件，就可以构建成工作所需的新载体。

许多实用的质粒载体都是在pBR322的基础上改建而成。可见其原型质粒在使用上有优点。有过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切酶只有单一切口的位点也多达数十个，几乎具备了所有常用限制酶都能切开并插入目的基因的优越条件。有两个抗药性基因（Ampr和Tetr）.

此外，pBR322DNA被限制性内切酶消化后产生的片段大小均已知道，可以作为核酸电泳的分子质量标准。普通型载体pBR322的结构图插入失活法以pBR322为基础的重组子筛选方法2）pUC18/pUC19质粒系列

pUC质粒系列是在pBR322基础上改建成的。它含有pBR322的大部分，包括完整的Ampr基因和复制起始点。去除了pBR322的tetr区段，换用了M13噬菌体的476bp片段，含LacZ基因及其启动子的操纵基因、M13的多聚接头polylinker。

pUC18与pUC19只是多克隆位点的排列方向相反，其余一致。476bp片段含有E.coli的LacZ基因的5’序列，表达半乳糖苷酶的α片段。

LacZ的上游包括乳糖操纵子上的启动子Plac和操纵基因O。

LacZ之内是M13的克隆位点。三个显著特点：（1）分子量更小，仅为2.7kB，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（每个细胞含500-700个拷贝）。（2）含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα，可利用α-互补原理进行蓝白斑筛选。（3）多克隆位点区（multiplecloningsite,MCS）由人工合成的多个单一酶切位点构成。其MCS区与M13mp噬菌体载体的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接转移到M13mp载体，进行DNA测序和体外突变等研究。2023/1/23213）pUC118/pUC119质粒系列在pUC18/pUC19质粒基础上，增加了带有M13噬菌体DNA合成的起始和终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列，也称为噬菌粒。4）pGEM-3Z/4Z质粒系列在pUC18/pUC19质粒基础上，在多克隆位点两端添加了噬菌体的转录启动子，可用于体外转录和翻译。5）多功能质粒载体典型的为pBluescriptⅡKS(±)、pBluescriptⅡSK(±)，具有多克隆位点、α-互补、噬菌体启动子、单链噬体的复制与包装信号等。K=KpnⅠ，S=SacⅠ2023/1/23222、表达载体一般是在克隆的载体上添加和完善了用于外源基因表达的一些基本元件，如强启动子、蛋白纯化标签、信号肽、诱导表达元件等。如Novagen的pET系列、Qiagen的pQE系列。以后有详讲解。第二节

λ噬菌体载体一、λ噬菌体的分子生物学λ噬菌体的组成结构和用途噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细胞一样，噬菌体侵犯细菌，也可以认为它是细菌里的“寄生虫”。它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。λ噬菌体为线性双链DNA的细菌病毒，具有互补的12bp粘性末端，感染细菌后粘端互补成双链环状。全长48531bp，含50多个基因。λ噬菌体基因大致分为4个区：结构区：A～J19个基因，编码头、尾部蛋白质为结构区。组区att(attachment)、int(intagrate)及xis(excission)。调控区启动子、终止子和N、CI基因。裂解区：Q-R。2023/1/2326λ噬菌体可以容纳较大的目的基因。例如用置换法可去掉长达20kb的λDNA，换入相应长度的目的基因。基因文库构建常使用λ载体。不少先进的质粒应用λ组件进行构建。二、λ载体的选择标记1、基因组大小：原基因组的75-105%大小时可以包装，否则不能包装。2、LacZ基因：象质粒一样进行蓝白斑筛选。3、cⅠ基因失活：该基因表达时促进进入溶原状态，该基因失活后促进进入裂解状态。三、代表性的λ载体1、插入型λ载体：如λgt10、λgt11、Λgem-2/4、λZAPⅡ、λExCell等，一般采用单一切点将λ切开，插入外源DNA，容量只有0-11kb，主要用于cDNA文库构建、表达融合蛋白、合成探针等。2、置换型λ载体：λ的中间裂解生长的非必须区段可以用外源DNA替代，形成填充区段，因此允许的外源DNA可达到9-23kb，代表性载体有EMBL3/4、λ2001、λDASH、λFIX、λGEM-11等，主要用于构建基因组DNA文库。2023/1/2328四、λ载体的克隆原理和步骤1、通过裂解过程增殖λ载体。2、载体与外源DNA的酶切。载体一般要纯化左路、右臂，并进行去磷酸化处理。3、外源DNA与载体的连接，形成的是多联体。4、重组噬菌体的体外包装，需要单独制备衣壳蛋白，包装过程对DNA大小有选择性。5、包装后的噬菌体颗粒感染大肠杆菌，经过λ的复制、包装和裂解过程，重组载体得到扩增，一个λ的感染和扩增会导致它周围一圈范围内的大肠杆菌被溶解，形成透明的溶菌圈/噬菌斑(plaque)。6、筛选。每个噬菌斑代表了一个重组λ，所有噬菌斑的集合就为一个文库。pfu:plaqueformingunit，噬菌斑形成单位，指每微克包装λDNA感染大肠杆菌后形成的噬菌斑数，要求100万以上。2023/1/2329第三节单链丝状噬菌体载体一、M13噬菌体载体

M13噬菌体属丝状噬菌体，其基因组为闭合环状正链ssDNA，6407bp，其中90%的DNA都编码蛋白质，有10个基因，有两个较长的间隔区，是外源基因插入的部位。M13噬菌体产生单双链DNA的机制。1、以(+)链DNA为摸板，合成互补(－)链，该双链称复制型DNA（RFDNA）。2、RFDNA在宿主细胞内能快速增殖，达每个细胞约200个拷贝。3、单链特异的DNA结合蛋白结合在(+)链上，从而阻断了其互补链，即(－)链的合成，这样，细胞就会不断的合成(+)链DNA。20