分子生物学分子克隆技术

分子生物学分子克隆技术1第一页，共八十二页，2022年，8月28日参考书目资料《分子克隆实验指南》（第三版）：美J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译，科学出版社，2008.《GeneIX》：BenjaminLewin编著.《基因工程原理》：吴乃虎，科学出版社，1998.《分子生物学实验指导》：郜金荣，叶林柏，武汉大学出版社，2007.《基因工程》：张惠展，华东理工大学出版社，2005.第二页，共八十二页，2022年，8月28日分子克隆第三页，共八十二页，2022年，8月28日第四页，共八十二页，2022年，8月28日基因工程是指在微观领域（分子水平）中，根据分子生物学和遗传学原理，设计并实施一项把一个生物体中有用的目的DNA(遗传信息)转入另一个生物体中，使后者获得新的需要的遗传性状或表达所需要的产物，最终实现该技术的商业价值。基因工程的基本特点是，分子水平操作，细胞水平表达。基因工程基因工程与建筑工程第五页，共八十二页，2022年，8月28日重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业。重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。该技术包括了一系列的分子生物学操作步骤。基因工程的核心技术是DNA重组技术第六页，共八十二页，2022年，8月28日分子克隆技术

又称为重组DNA技术，是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序。供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。第七页，共八十二页，2022年，8月28日重组DNA操作一般步骤：（1）获得目的基因；（2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；（3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；（4）对转化子筛选和鉴定；（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。第八页，共八十二页，2022年，8月28日获得需要的目的基因（外源基因）获得需要的目的基因常用的方法：（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因文库(genelibrary)，从中调用目的基因；（2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段；（3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，等等。第九页，共八十二页，2022年，8月28日细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建细胞内总DNA的提取分离程序第十页，共八十二页，2022年，8月28日紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。第十一页，共八十二页，2022年，8月28日基因工程的工具酶“手术刀”专司切割之职，内切酶“缝纫针”具有连接之功，连接酶“复印机”行使复制之责，DNA聚合酶第十二页，共八十二页，2022年，8月28日(“交通工具车子”)——载体有了切割与缝合（ligase）基因DNA的工具，还得有一个“车子”将重组DNA送到宿主细胞中去。

第十三页，共八十二页，2022年，8月28日逆转录酶使真核基因的制备成为可能。

（1）真核基因组庞大而复杂，不易制得基因图谱。（2）即使有了基因图谱，因为真核基因有内含子，不能在原核表达系统剪接出mRNA，没有成熟的mRNA就不能得到相应得产物。（3）经过逆转录mRNA→cDNA(complementoryDNA)得到的cDNA文库要比基因组文库小得多，所以筛选阳性克隆就方便得多。

第十四页，共八十二页，2022年，8月28日四、分子克隆的技术支撑核酸凝胶电泳技术核酸分子连接技术细菌转化技术DNA序列分析技术寡核苷酸合成技术基因定点突变技术聚合酶链反应（PCR）技术DNA序列测定技术第十五页，共八十二页，2022年，8月28日核酸凝胶电泳第十六页，共八十二页，2022年，8月28日细菌转化技术（包括感受态细胞制备）第十七页，共八十二页，2022年，8月28日聚合酶链反应（PCR）技术第十八页，共八十二页，2022年，8月28日大规模生产生物活性物质野生细胞野生细胞分离工程酶分离工程基因工程蛋白质工程途径工程

工程细胞发酵工程酶工程细胞工程生物活性物质第十九页，共八十二页，2022年，8月28日第二十页，共八十二页，2022年，8月28日

用携带了外源基因的农杆菌Ti质粒转化植物原生质体，发育成具有新性状的完整植株——转基因植物。

第二十一页，共八十二页，2022年，8月28日基因工程的工具酶“手术刀”专司切割之职“缝纫针”具有连接之功“复印机”行使复制之责内切酶连接酶聚合酶第二十二页，共八十二页，2022年，8月28日内切酶“手术刀”专司切割之职“缝纫针”具有连接之功“复印机”行使复制之责内切酶连接酶聚合酶第二十三页，共八十二页，2022年，8月28日内切酶第二十四页，共八十二页，2022年，8月28日同裂酶(Isoschizomers）第二十五页，共八十二页，2022年，8月28日同尾酶第二十六页，共八十二页，2022年，8月28日星活性*所谓星活性又称Star活性。是指由于反应条件不同而产生的切断与原来认识序列不同的位点的现象，也就是说产生Star活性后，不但可以切断特异性的识别位点，还可以切断非特异性的位点。产生Star活性的结果是酶切条带增多。Differenceswhichcanleadtostaractivityincludelowionicstrength,highpH,andhigh(>5%v/v)glycerolconcentrations.HighFidelity(HF)RestrictionEnzymescanbeusedtoreducestaractivity.第二十七页，共八十二页，2022年，8月28日第二十八页，共八十二页，2022年，8月28日DNA聚合酶Taq酶 用Taq酶扩增DNA时常使片段3‘端凸出一个A。Pfu酶 产生平末端产物。第二十九页，共八十二页，2022年，8月28日连接酶T4DNALigase(invitrogen)16°C过夜或者室温1-2个小时了连接即可。第三十页，共八十二页，2022年，8月28日基因工程的载体---用于扩增第三十一页，共八十二页，2022年，8月28日克隆载体必备条件（1）具有复制起点（2）具有抗菌素抗性基因（3）具有若干限制酶单一识别位点（4）具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。第三十二页，共八十二页，2022年，8月28日表达型基因工程的载体----以PET32为例第三十三页，共八十二页，2022年，8月28日多克隆位点第三十四页，共八十二页，2022年，8月28日宿主要考虑宿主菌对密码子的偏爱性大肠杆菌不同密码子的偏爱性问题，将64组密码子分为强、中、弱密码子第三十五页，共八十二页，2022年，8月28日目的产物目的基因不溶性的高效表达过程：目的基因编码的真核蛋白质与宿主基因编码的原核多肽或或其它基因编码的具有其它功能的多肽和结合在一起，这种结合在一起的形成的不溶性无活性的包涵体，又叫为融合蛋白。举例：胰岛素与β-半乳糖苷酶形成包涵体优点：避免细菌蛋白酶破坏，提高目的基因表达产物产量。缺点：需要经过溶解和复性才能获得有活性的适合：不需要翻译后修饰的蛋白质产物第三十六页，共八十二页，2022年，8月28日目的基因的高效分泌表达概念：目的蛋白分泌到细胞周质和目的蛋白转运到细胞周质后再分泌到细胞外优点：①防止宿主菌对表达产物的降解；②有利于蛋白质正确折叠，形成天然构象③减轻宿主细胞代谢负荷④有利于分离需要在质粒设计时加入一段信号肽基因第三十七页，共八十二页，2022年，8月28日基因克隆操作过程第三十八页，共八十二页，2022年，8月28日克隆示意图第三十九页，共八十二页，2022年，8月28日克隆示意图第四十页，共八十二页，2022年，8月28日克隆技术流程分切连转筛第四十一页，共八十二页，2022年，8月28日分分离（来自生物组织）、扩增（设计引物，PCR扩增）mRNA-------DNA------扩增第四十二页，共八十二页，2022年，8月28日引物设计与订购酶切位点双酶切、保护碱基、最合适的缓冲液。引物订购第四十三页，共八十二页，2022年，8月28日保护碱基第四十四页，共八十二页，2022年，8月28日1.用限制性酶消化

DNA样品第四十五页，共八十二页，2022年，8月28日单酶切第四十六页，共八十二页，2022年，8月28日双酶切第四十七页，共八十二页，2022年，8月28日选择合适的双酶切缓冲液第四十八页，共八十二页，2022年，8月28日2.用限制性内切酶消化质粒DNA第四十九页，共八十二页，2022年，8月28日3.连接样品DNA和质粒DNA的消化产物第五十页，共八十二页，2022年，8月28日连接前最好要定量连接比例摩尔比例为： 插入片度：质粒=10:1---5:1为佳。质粒几十个ng为佳。第五十一页，共八十二页，2022年，8月28日双酶切EcoRⅠ切割位点Bg

lⅡ切割位点+EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。第五十二页，共八十二页，2022年，8月28日冷循环器第五十三页，共八十二页，2022年，8月28日4.用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞转化细菌有两个基本方法。一是

化学法，即用CaCl2

处理并加热激以促进DNA进入菌体；二是电激法，即

施加短脉冲的电荷以促进DNA吸收。第五十四页，共八十二页，2022年，8月28日用氯化钙化学转化第五十五页，共八十二页，2022年，8月28日用氯化钙化学转化第五十六页，共八十二页，2022年，8月28日电激转化第五十七页，共八十二页，2022年，8月28日一个电激转化程序加50-200ngDNA到40ul电激感受态细菌中将混合物放入一个预冷的电激杯中施以脉冲电处理，脉冲长度预期值为8to12ms立即加1mlLB培养液，在室温下振荡2-4小时。

分别取10ul和100ul涂布在到两个加有抗菌素的LB琼脂平板上，保温培养1天。第五十八页，共八十二页，2022年，8月28日5.

细菌在加有Amp+X-Gal的培养基上生长以进行筛选连接会有三种结果，一是要插入的序列自连；二是切开的质粒重连；三是要插入的序列与质粒相连。第一种连接结果没有菌落形成。第二种连接结果表现为蓝色菌落。只有后一种结果是符合需要的，产生白色的抗氨苄青霉素菌落。第五十九页，共八十二页，2022年，8月28日灭菌器第六十页，共八十二页，2022年，8月28日加IPTG和X-GAL第六十一页，共八十二页，2022年，8月28日倒平板第六十二页，共八十二页，2022年，8月28日

α互补利用α互补原理筛选重组体pUC18第六十三页，共八十二页，2022年，8月28日筛选结果蓝菌落代表含有质粒的耐药菌，表达出由完好的α

LacZ序列编码的功能性的

α

片段。白菌落代表含有质粒的耐氨苄青霉素菌，质粒上α

LacZ序列上有插入片段。第六十四页，共八十二页，2022年，8月28日乳糖和诱导物IPTG的化学结构isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside第六十五页，共八十二页，2022年，8月28日X-galX-Gal是β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的显色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。常用于β-半乳糖苷酶的原位染色检测以及蓝白斑筛选。

第六十六页，共八十二页，2022年，8月28日X-gal水解第六十七页，共八十二页，2022年，8月28日筛选结果模式图第六十八页，共八十二页，2022年，8月28日蓝菌落建议用DH5α做宿主菌。

第六十九页，共八十二页，2022年，8月28日蓝白菌落第七十页，共八十二页，2022年，8月28日电泳仪第七十一页，共八十二页，2022年，8月28日经过双酶切、PCR等鉴定，送阳性克隆测序。提取正确的克隆菌中的质粒，转入表达型的菌株，如BL21等。诱导表达蛋白第七十二页，共八十二页，2022年，8月28日鉴定方法第七十三页，共八十二页，2022年，8月28日

PCR鉴定第七十四页，共八十二页，2022年，8月28日

原位杂交第七十五页，共八十二页，2022年，8月28日鸡的β肌球蛋白的克隆和检出免疫学方法第七十六页，共八十二页，2022年，8月28日蛋白质的纯化第七十七页，共八十二页，2