分子克隆工具酶

分子克隆工具酶第一页，共九十页，2022年，8月28日在基因工程的实际操作中，工具酶的使用是一项基本技术。用于基因工程的工具酶种类繁多、根据其功能可粗略分为限制酶、连接酶、聚合酶和修饰酶4类。第二页，共九十页，2022年，8月28日工具酶类 主要用途限制性核酸内切酶 切割DNA分子形成片段DNA连接酶 DNA片段的连接重组大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 切口平移法标记DNA探针T7DNA聚合酶 DNA序列测定分析TaqDNA聚合酶 PCR体外扩增技术多核苷酸激酶 末端标记法制备探针S1核酸酶 去除双链DNA的局部单链常用工具酶与基因克隆技术第三页，共九十页，2022年，8月28日

核酸酶是通过切割相邻的两个核苷酸残基间的磷酸二酯键，导致多核苷酸链共价键断裂的一类水解酶，可分为核糖核酸酶(RNase)和脱氧核糖核酸酶(DNase)。按其水解断裂核酸分子的不同方式：核酸外切酶(exonuclease):从核酸末端顺次水解磷酸二酯键核酸内切酶(endonuclease)：内部磷酸二酯键2.1限制性核酸内切酶第四页，共九十页，2022年，8月28日寄主控制的限制(restriction)与修饰(modification)现象：人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。λ噬菌体在感染某一宿主后，再去感染其他宿主时会受到限制。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解。2.1.1限制性核酸内切酶的发现及其生物功能第五页，共九十页，2022年，8月28日限制与修饰现象图解Arber限制修饰酶第六页，共九十页，2022年，8月28日1968年，MeselsonandYuan从E.coli菌株Ｋ和Ｂ中发现了Ⅰ型限制酶；1970年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出HindII。

第七页，共九十页，2022年，8月28日限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。限制（Restriction）第八页，共九十页，2022年，8月28日细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。①Dam甲基化酶GATC腺嘌呤N6位置引入甲基。②Dcm甲基化酶

CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基。修饰（Modification）第九页，共九十页，2022年，8月28日第十页，共九十页，2022年，8月28日2.1.2限制酶的分类与命名限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源DNA的一类酶，其功能是避免外源DNA的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。根据酶的功能、大小和反应条件，及切割DNA的特点，可以将限制性内切酶分为三类：Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、Ⅲ型酶。第十一页，共九十页，2022年，8月28日三种类型限制酶的主要特性差异比较距识别序列下游24-26bp处识别序列内或附近特异性切割距识别序列1kb处随机性切割切割位点GAGCCCAGCAG旋转对称序列TGAN8TGCTAACN6GTGC识别序列ATP、Mg2+、SAMMg2+ATP、Mg2+、SAM（S-腺苷甲硫氨酸）辅助因子异源二聚体同源二聚体异源三聚体蛋白结构双功能单功能多功能限制修饰

Ⅲ型Ⅱ型I型主要特性第十二页，共九十页，2022年，8月28日

I型酶属复合功能酶，兼具限制、修饰两种功能。核酸内切酶、甲基化酶、ATP酶和DNA解旋酶4种活性。

显著特点：识别位点与切割位点不一致。酶分子首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌

B株和

K株分离的。

代表：EcoB和EcoK。I型限制性内切酶第十三页，共九十页，2022年，8月28日识别位点序列EcoB：

TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC未甲基化修饰的特异序列。需ATP、Mg2+和SAM(S-腺苷甲硫氨酸)。作用机理第十四页，共九十页，2022年，8月28日在距离特异性识别位点约1000～1500bp处随机切开一条单链。Recognizesitecut1-1.5kb切割位点第十五页，共九十页，2022年，8月28日有核酸内切酶和甲基化酶作用。酶分子由两个亚基组成。M亚基负责位点识别与修饰，R亚基具有核酸酶活性。在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、

Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸

）。在基因工程操作中用途不大。EcoP1:AGACC

EcoP15:

CAGCAGⅢ类限制性内切酶第十六页，共九十页，2022年，8月28日

1970年，由H.O.Smith和K.W.Wilcox（威尔科克斯）从流感嗜血菌中分离出来。分离的第一个酶是HindⅡ。

限制-修饰系统分别由限制酶与修饰酶两种不同酶分子组成，分子量小，能识别DNA的特殊序列，种类多，在基因工程中起重要作用。Ⅱ型限制性内切酶第十七页，共九十页，2022年，8月28日

能识别双链DNA的特殊序列，并在这个序列内进行切割，产生特异的DNA片段。其种类繁多。通常所指的DNA限制性核酸内切酶即为此类。

在基因工程技术中，I型不能用，Ⅲ型酶基本不用，Ⅱ型酶最有用。第十八页，共九十页，2022年，8月28日限制酶的命名1973年Smith和Nathans提出限制酶的命名原则，1980年Roberts对其系统化，如今简化成：HindⅢ，来源菌株Haemophilusinfluenzaed嗜血流感杆菌d株H

in

d

Ⅲ微生物属名种名株名(品系)发现序数第十九页，共九十页，2022年，8月28日识别双链DNA分子中4～8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构5’…GCTGAATTCGAG…3’3’…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的识别序列EcoRI的切割位点2.1.3Ⅱ型限制酶的特性与DNA切割

(1)基本特性大多为回文序列第二十页，共九十页，2022年，8月28日5’…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5’…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5’…G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C…5’OHPOHPEcoRI产生的5’粘性末端第二十一页，共九十页，2022年，8月28日5’…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃5’…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’退火4-7℃5’…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHPPstI产生的3’粘性末端第二十二页，共九十页，2022年，8月28日①连接便利

不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平齐末端容易的多。同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。粘性末端的意义第二十三页，共九十页，2022年，8月28日第二十四页，共九十页，2022年，8月28日③补平成平齐末端凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。②5’末端标记凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。第二十五页，共九十页，2022年，8月28日5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuⅡ37℃5’…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’PvuⅡ等产生的平头末端第二十六页，共九十页，2022年，8月28日常用的限制酶及其识别序列和切割位点名称识别序列及切割位点名称识别序列及切割位点BamHⅠG↓GATCCPstⅠ

CTGCA↓G

ClaⅠAT↓CGATSalⅠG↓TCGACEcoRⅠG↓AATTC

Sau3AⅠ↓GATCHindⅢA↓AGCTTSfiⅠGGCCNNNN↓NGGCCHindⅡ

CTPy↓PuACSmaⅠCCC↓GGGKpnⅠGGTAC↓CXbaⅠT↓CTAGANotⅠGC↓GGCCGCXhoⅠC↓TCGAG第二十七页，共九十页，2022年，8月28日同裂酶（Isoschizomers)识别位点的序列相同的限制性内切酶。完全同裂酶识别位点和切点完全相同。如HindⅢ

和HsuI。HindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’(2)同裂酶与同尾酶第二十八页，共九十页，2022年，8月28日XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’识别位点相同，但切点不同。如XmaI和

SmaI。不完全同裂酶第二十九页，共九十页，2022年，8月28日识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、Xho

Ⅱ等。5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’Bgl

Ⅱ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’Xho

ⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。同尾酶(Isocaudamers）第三十页，共九十页，2022年，8月28日5’-GATC----3’3’----CTAG-5’Sau3AI同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。？5’-G3’-CCTAG

GATCT-3’

A-5’BamHIBgl

ⅡSau3AI5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’BamHIBgl

Ⅱ第三十一页，共九十页，2022年，8月28日限制酶识别序列与DNA的来源无关，不具有种的特异性，对不同的DNA普遍适用。识别序列的长短涉及对DNA分子切割的频率，可从理论上推导酶切DNA片段的大小。(3)Ⅱ型限制酶的识别序列与DNA的切割第三十二页，共九十页，2022年，8月28日限制酶识别序列的相邻序列（长度要求）效应。大多数限制酶对只含识别序列的寡核苷酸也不具催化活性的。限制酶的偏爱现象。限制酶对识别序列两侧的核苷酸的组成有关。（对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率）限制酶的星星活性。指某些限制酶在不适的环境中其识别序列发生改变（切割与识别序列相似的序列）的现象。第三十三页，共九十页，2022年，8月28日(1)底物DNA样品的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等。①加大酶的用量②加大反应总体积（稀释）③延长反应时间2.1.4影响限制性核酸内切酶活性的因素当DNA样品确定后，为完全切割此DNA，酶的用量视酶的催化活性而定。酶活力单位：在最佳反应条件下反应1h，完全水解1mg标准λDNA所需的酶量定为1U。第三十四页，共九十页，2022年，8月28日修饰体系组成部分，强烈影响酶的活性。大肠杆菌中的dam甲基化酶在5’GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基。受其影响的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影响。E.coli的dcm甲基化酶在5’CCAGG3’或5’CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基。受其影响的酶有EcoRII等。(2)DNA样品的甲基化程度第三十五页，共九十页，2022年，8月28日不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37℃，少数要求40℃～65℃。酶最适温度℃酶最适温度℃ApaIBclIMaeIITaqIApyI3050506530BstEIIMaeIIIBanIMaeISmaI6055504525(3)酶切消化反应的温度第三十六页，共九十页，2022年，8月28日缓冲液组分包括：氯化镁、氯化钠或氯化钾、β-巯基乙醇或DTT（二巯基苏糖醇）、BSA（牛血清白蛋白）、Tris-HCl等。高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些限制酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Staractivity现象。每种酶只有在最适的反应缓冲液中才具有最强的催化活性。(4)核酸内切酶的缓冲液性质第三十七页，共九十页，2022年，8月28日大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件II型限制性核酸内切酶酶解反应的操作0～50mM低盐酶；100mM中盐酶；150mM高盐酶MgCl2、NaCl/KCl：

提供Mg2+和离子强度；Tris-HCl：

维持pH；二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；试剂条件试剂条件Tris-HCl50mMpH7.5DTT1mMMgCl210mMVolume20-100µlNaCl0-150mMTt37℃1-1.5h第三十八页，共九十页，2022年，8月28日对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解；低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切；一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切。Ⅱ

型核酸内切酶的多酶联合酶解第三十九页，共九十页，2022年，8月28日修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键。DNA连接酶OHPnick5’…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPnick2.2DNA连接酶5’…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’第四十页，共九十页，2022年，8月28日大肠杆菌DNA连接酶只能催化双链DNA的互补黏性末端，以NAD+为能量。

T4噬菌体连接酶黏性、平末端均可连接，以ATP为能量。2.2.1基本性质第四十一页，共九十页，2022年，8月28日2.2.2DNA连接酶的连接作用1）必须是两条双链DNA。2）DNA3’端有游离的-OH，

5’端有一个磷酸基团（P）。3）需要能量

动物或噬菌体中：ATP大肠杆菌中：NAD+(1)连接条件第四十二页，共九十页，2022年，8月28日第四十三页，共九十页，2022年，8月28日1UDNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15℃反应1h，完全连接1mgl-DNA（HindⅢ片段）所需的酶量。试剂条件试剂条件Tris-HCl50～100mM,pH7.5DTT5mMMgCl210mMVolume10-20mlATP0.5-1mMTt4-15℃4-16h(2)DNA连接酶反应条件第四十四页，共九十页，2022年，8月28日ATP（NAD+)提供激活的AMP。ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。AMP与连接酶的赖氨酸-氨基相连。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2++H3NAMPATPPPi(3)连接反应过程“连接酶-AMP”复合物第四十五页，共九十页，2022年，8月28日AMP随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA一条链的5’端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。-OHHO-P-AMP-OHO-P-AMPDNA-腺苷酸”复合物第四十六页，共九十页，2022年，8月28日3’-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。第四十七页，共九十页，2022年，8月28日连接多个平头双链DNA分子：5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C

…5’5’…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G

…3’3’…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C

…5’T4-DNA连接酶T4DNA连接酶第四十八页，共九十页，2022年，8月28日10～20倍。增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。(1)插入片段与载体的浓度比例

(2)反应温度一般14~16℃。3.酶用量2.2.3影响连接反应的因素第四十九页，共九十页，2022年，8月28日2.3DNA聚合酶常用的聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶KlenowfragmentT7DNA聚合酶T4DNA聚合酶修饰过的T7DNA聚合酶逆转录酶催化以DNA为模板合成DNA的一类酶。第五十页，共九十页，2022年，8月28日DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低无中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高化学修饰T7DNA聚合酶无无快高逆转录酶无无低中TaqDNA聚合酶无有快高常用DNA聚合酶的特性比较第五十一页，共九十页，2022年，8月28日共同特点把dNTPs连续地加到引物的3’-OH端。主要区别持续合成能力和外切酶活性不同。

T7DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。其它几种聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。常用的DNA聚合酶的特点第五十二页，共九十页，2022年，8月28日基本性质：5’→3’的DNA聚合酶活性5’→3’的核酸外切酶活性3’→5’的核酸外切酶活性3’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5’…C-G-A-G-T-OH5’pppdNTPMg2+3’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OHDNApolⅠ2.3.1E.coliDNA聚合酶Ⅰ(DNApolⅠ)第五十三页，共九十页，2022年，8月28日缺口前移标记法5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’5’…G-C-T-CA-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’Nicktranslation制备32P标记的探针DNaseⅠMg2+5’dNTP5’pppdA（a-32P-dATPDNApolⅠ基本用途第五十四页，共九十页，2022年，8月28日基本性质大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三分之二的大肽段，即为Klenow酶；Klenow酶仍拥有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性，但失去了5’→3’的核酸外切酶活性。2.3.2E.coliDNA聚合酶I大片段(Klenow)第五十五页，共九十页，2022年，8月28日基本用途补平由核酸内切酶产生的5’粘性末端DNA片段的同位素末端标记cDNA第二链的合成双脱氧末端终止法测定DNA序列第五十六页，共九十页，2022年，8月28日补平由核酸内切酶产生的5’粘性末端5’…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’KlenowdATPdTTP5’…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’第五十七页，共九十页，2022年，8月28日DNA片段的同位素末端标记5’…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’Klenowa-32P-pppdAdTTP5’…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’第五十八页，共九十页，2022年，8月28日3’隐蔽末端的DNA片断Klenowfragment补平根据末端的顺序选择一种

-32P-dNTPs末端标记的DNA

限制性内切酶切5’----G3’3’----CTTAA5’5’----GAA3’3’----CTTAA5’5’----GAATT3’3’----CTTAA5’5’----G3’3’----CCTAG5’5’----GG3’3’----CCTAG5’5’----GGATC3’3’----CCTAG5’EcoRIBamHI-32P-dATP-32P-dGTP25℃1h第五十九页，共九十页，2022年，8月28日mRNAcDNA第一链逆转录cDNA第二链klenow5’3’3’5’5’3’引物cDNA第二链的合成第六十页，共九十页，2022年，8月28日2.3.3T4-DNA聚合酶基本特性5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性；在无dNTP时，可以从任何3’-OH端外切；在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止；在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。第六十一页，共九十页，2022年，8月28日切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端5’…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-P

HO-A-C-G-T-C-C-T-C…5’T4-DNA聚合酶5’…G-C-T-C-OH

P-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-P

HO-C-C-T-C…5’注意：该酶也能降解双链DNA，只是其活性比单链降解活性低很多。基本用途第六十二页，共九十页，2022年，8月28日DNA片段的同位素末端标记5’G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3’C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5’5’G-C-T-CA-G-C-T-G-OH

HO-T-C-G-A-C-C-T-C-A5’T4-DNApolMg2+5’pppdN5’pppdA（a-32P-dATP）T4-DNApol5’G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3’C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5’第六十三页，共九十页，2022年，8月28日从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成：①T7基因5编码的大亚基：有5’3’聚合酶和3’5’外切酶活性。②大肠杆菌编码的小亚基：增加大亚基对模板的亲和性。2.3.4T7-DNA聚合酶第六十四页，共九十页，2022年，8月28日①持续合成能力强一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。②

3’5’外切酶活性高单链和双链都能降解。③不受DNA二级结构的影响其它DNA聚合酶受DNA二级结构的阻碍。T7DNA聚合酶的特点第六十五页，共九十页，2022年，8月28日②进行末端标记①

以大分子量DNA为模板的合成如M13③补平隐蔽末端3’末端标记。与T4DNA聚合酶相同。合成补平3’隐蔽末端；水解修平3’突出末端。用途第六十六页，共九十页，2022年，8月28日T7DNA聚合酶的化学修饰去除3’5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。修饰后的T7DNA聚合酶的用途①

DNA测序双脱氧法。②标记DNA3’隐蔽末端③更有效地补平末端修饰后的T7DNA聚合酶第六十七页，共九十页，2022年，8月28日基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链反转录酶Mg2+dNTP3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-183’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTTTT3’cDNA2.3.5反转录酶第六十八页，共九十页，2022年，8月28日双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链反转录酶3’RNA5’

DNA3’5’3’RNA5’

DNA3’5’反转录酶5’

DNA3’基本特性第六十九页，共九十页，2022年，8月28日2.4修饰酶类在基因克隆技术中，除了限制酶、连接酶、聚合酶这些主要的工具酶外，还经常使用某些酶的相关功能对DNA或RNA进行分子修饰，以使操作更加巧妙、简便和高效。第七十页，共九十页，2022年，8月28日单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+ExoVII3’5’3’5’3’5’3’5’2.4.1核酸酶第七十一页，共九十页，2022年，8月28日ExoVⅢ3’5’3’5’Mg2+3’5’3’5’大肠杆菌的核酸外切酶III特异性地从3’端外切双链核酸外切酶：核酸外切酶Ⅲ（ExoⅢ）第七十二页，共九十页，2022年，8月28日lExoMg2+Ⅰ核酸外切酶特异性地从5’端外切3’5’3’5’双链核酸外切酶：Ⅰ核酸外切酶(ⅠExo)3’5’3’5’第七十三页，共九十页，2022年，8月28日S1核酸酶的基本特性单链核酸内切酶：S1核酸酶来自稻谷曲霉菌（Aspergillusoryzae）降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍Zn2+必需最适pH范围为4.0~4.3需要NaCl浓度10~300mM降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍第七十四页，共九十页，2022年，8月28日内切单链DNA或RNA5’…G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T…3’S1Zn2+5’…G-C-T-C-A-G-C-T-CT-T-G-A-G-G-A-G-T…3’5’…G-C-T-CA-G-C-T-CT-T-G-A-GG-A-G-T…3’5’dNMPs或5’NMPs基本反应第七十五页，共九十页，2022年，8月28日内切带切口或缺口的双链DNA或RNA5’…G-C-T-C-A-GC-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C

A-C-C-T-C-A…5’nickgapS1Zn2+5’…G-C-T-C-A-G3’…C-G-A-G-T-CT-G-G-A-G-T…3’A-C-C-T-C-A…5’基本反应第七十六页，共九十页，2022年，8月28日在DNA上定位RNA（S1mapping）DNAmRNA杂交S1EcoRI重要用途第七十七页，共九十页，2022年，8月28日基本特性：来自艾氏交替单胞菌（A.espejiana）Ca2+5’dNMPs或5’NMPsssDNAorRNACa2+Ca2+单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶第七十八页，共九十页，2022年，8月28日诱发DNA突变EcoRIABCEcoRIEcoRIBCABal31BCA环化ACBal31核酸酶的基本用途第七十九页，共九十页，2