基因工程的操作程序

复习回顾1、基因工程又称为？基因工程的原理是?2、基因工程中用到的工具中，“分子手术刀”是？来源是？其作用是？体现了酶的什么特性？作用部位是什么键？3、限制酶切割之后的结果是产生？从中轴线两侧切割得到的是什么末端？从中轴线处切开呢？4、获得目的基因需要切几个切口？产生几个黏性末端？切割质粒呢？5、“分子缝合针”是？根据什么分为两大类？哪两大类？这两类酶的区别是？6、DNA连接酶连接的是？DNA聚合酶连接的是？7、DNA连接酶作用于什么键？8、载体主要有哪几类？其中，最常用的是？它的本质是？9、载体必须具备的四个条件是？10、写出限制酶切割后的黏性末端。基因工程的基本操作程序原核细胞的基因结构(补充内容）非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子①不编码蛋白质。：编码蛋白质,连续不间断编码区非编码区原核细胞的基因结构②调控遗传信息表达,上游有启动子，下游有终止子真核细胞的基因结构（补充内容）编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子启动子终止子编码区上游编码区下游真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用,上游有启动子，下游有终止子非编码序列：包括非编码区和内含子

基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定问题1一：目的基因的获取

如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。

1.目的基因主要是指___________________编码蛋白质的基因目的基因指的是：？也可以是具有调控作用的因子获取目的基因的常用方法有哪些?1、从基因文库中获取目的基因2、利用PCR技术扩增目的基因3、人工合成目的基因反转录法化学合成法(一)从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库1.基因文库概念2.基因文库类型基因组文库部分基因文库（包含一种生物的所有基因）（包含一种生物的一部分基因）(一)从基因文库中获取目的基因3.基因组文库的构建提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接导入受体菌中储存基因组文库4.cDNA文库的构建建提取某种生物物的某器官或或特定发育时期的mRNA单链DNA双链cDNA片段重组载体与载体连接接cDNA文库库反（逆）转录录酶DNA聚聚合酶导入受体菌中中储存两种基因文库库的主要区别别如下表（课课本P10））文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子无有基因中内含子无有基因多少部分基因全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以总结1、概念：PCR全称为为________________，是一项项在生物____复复制_____________的的核酸合成技技术3、条件：2、原理：__________多聚酶链式反反应体外特定DNA片段DNA双链复制(二)利用PCR技术术扩增增目目的的基基因因模板板（目目的的基基因因））原料料(脱脱氧氧核核苷苷酸酸)引物物（一一小小段段单单链链DNA））耐高高温温的的DNA聚聚合合酶酶（（Taq酶酶））温度度控控制制4、、操操作作前前提提：：一段段已已知知目目的的基基因因的的核核苷苷酸酸序序列列，，以以便便合合成成引引物物。。6、结果果：5、扩增增形式：：指数形式式（2n）在短时间间内大量量扩增目目的基因因7、过程程：a、变性性（90℃℃-95℃）：：双链DNA模模板在热热作用下，_____断裂裂，形成成___________b、复性性（55℃℃-60℃）：：系统温温度降低低，引物物与DNA模模板结合合，形成成局部________。c、延伸伸（70℃℃-75℃）：：在Taq酶的的作用下下，从引物开始始进行碱碱基互补补配对，，合成与与模板互补补的________。氢键单链DNA双链DNA链(二)利利用PCR技术术扩增目目的基因因动画演演示（三）人人工合成成目的基基因反转录法法：以目的基基因转录录成的信信使RNA为模模板，反反转录成成互补的的单链DNA，，然后在在酶的作作用下合合成双链链DNA，从而而获得所所需的基基因。化学合成成法DNA合成仪推测推测合成前提：基因比较较小、核核苷酸序序列已知知蛋白质的的氨基酸酸顺序mRNA核苷酸酸序列基因DNA的核核苷酸酸序列列目的基因问题43、如如果不不知道道目的的基因因的核核苷酸酸序列列，可可采用用_________________获取目目的基基因的的三种种方法法应用用1、如如果有有目的的基因因的核核苷酸酸序列列，而而且基基因比比较大大，可可采用用____________2、如如果知知道目目的基基因的的序列列，而而且基基因比比较小小，可可采用用________________PCR技术术扩增增化学合合成法法从基因因文库库获取取的方方法复习回回顾1、基基因工工程的的基本本操作作程序序的四四个步步骤是是？核核心是是？2、目目的基基因指指的是是什么么基因因？3、获获取目目的基基因常常用的的三种种方法法是？？其中中人工工合成成法又又包括括哪两两种?4、基基因文文库包包括哪哪两类类？5、PCR的原原理是是？PCR全称称是？？PCR扩扩增过过程中中的解解旋方方式是是？PCR需要要的条条件有有？6、基基因表表达载载体的的构建建的目目的是是？7、一一个基基因表表达载载体的的组成成包括括哪几几部分分？8、标标记基基因的的作用用是？？9、启启动子子，终终止子子的位位置，，作用用？起起始密密码子子，终终止密密码子子呢？？二：基基因表表达载载体的的构建建———基因因工程程的核心1目的：：使目的的基因因在受受体细细胞中中稳定存存在，并且且可以以遗传给给下一一代，同时时使目目的基基因能能够表达和和发挥挥作用。。2组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因等启动子子：位于基基因的的首端的一段段特殊殊的DNA片断断，RNA聚合合酶识别和和结合合的部部位，，启动动转录录终止子子：位于基基因的的尾端的一段段特殊殊的DNA片断断，能能终止mRNA的的转录录（与与终止止密码码子区区别））标记基基因：：鉴别受体细细胞中中是否否含有有目的的基因因，从从而将将有目目的基基因的的细胞胞筛选出来3.基因表表达载体的的构建过程程质粒DNA分子子限制酶处理理两个切口四个黏性末末端DNA连接接酶重组DNA分子（重重组质粒））同一种一个切口两个黏性末末端三、将目的的基因导入入受体细胞胞1转化概念：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2转化的实质：目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射法Ca2＋处理法受体细胞一般是体细胞受精卵-------------4、目的基因因导入受体体细胞的方方法1、将目的的基因导入入植物细胞胞的方法：：（1）农杆菌转化化法①农杆菌特点点：易感染双子子叶植物和和裸子植物物，对大多多数单子叶叶植物没有有感染能力力②原理：Ti质粒上上的T-DNA可以转移到到受体细胞胞，并整合合到受体细细胞染色体的DNA上。三、目的基基因导入受受体细胞构建基因表表达载体转入农杆菌植物细胞导入稳定维持和和表达③过程：（2）基因枪法：目的基因导导入单子叶植物物细胞基因枪法（3）花粉管通道道法：将目的基因因导入植物物细胞①操作方法法：在植物物花受粉后后，花粉形形成花粉管管还末愈合合前期，剪剪去柱头，，然后，滴滴入DNA（含的基基因）使目目的基因借借助花粉管管通道进入入受体细胞胞②特点:十分分简便经济济。③例：转基因因抗虫棉（（我国）（4）、将将目的基因因导入动物物细胞方法：显微注射法法目的基因表表达载体提纯取卵（受精卵））显微注射受精卵新新性状动物物为什么动物物细胞要用用受精卵做做受体细胞胞？全能性受限限制（5）、将将目的基因因导入微生生物细胞①微生物作受受体细胞优优点：繁殖快、多多为单细胞胞、遗传物物质相对少少②常用菌：：大肠杆菌菌③常用法：：Ca2+处理获得感感受态细胞胞（改变细胞胞壁的通透透性）④过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞感受态细胞胞吸收DNA表达载体与感受态细胞混合导入过程完完成后，全全部受体细细胞都能摄摄入入重组DNA分子吗吗？真正能摄入入重组DNA分子的的受体细胞胞很少，且且有的会摄摄入载体-载体，目目的基因-目的基因因类型目的基因进进入受体细细胞后，是是否都能稳稳定维持和和表达？不一定，需需要检测问题4问题5——检查是是否成功分子水平个体水平：：①检测转基基因生物染染色体的DNA上是否插入入了目的基基因②检测目的的基因是否否转录出了了mRNA③检测目的的基因是否否翻译成蛋蛋白质抗虫鉴定、、抗病鉴定定、活性鉴鉴定等方法、工具具：方法、工具具：方法、工具具：DNA分子子杂交、DNA探针针分子杂交、、DNA探探针抗原-抗体体杂交、抗抗体四、目的基基因的检测测与鉴定方法：接种实验转基因生物的DNA探针15N15N14N14N（1）检测转转基因生物物染色体的的DNA上上是否插入入了目的基因基因探针：：放射性同位位素等标记记的含有目目的基因DNA片段段方法——DNA分子子杂交技术术变性变性知识延伸——DNA分子子杂交技术术该方法是根根据碱基互互补配对原原则，把互互补的双链链DNA解解开，把单单股的DNA小片段段用同位素素、荧光分分子或化学学发光催化化剂等进行行标记，之之后同被检检测的DNA中的同同源互补序序列杂交，，从而检出出所要查明明的DNA或基因。。变性方法——分子杂交技技术（2）检测测目的基因因是否转录录出了mRNA探针15N15N转基因生物物的mRNA14N14N提取（3）检测测目的基因因是否翻译译成蛋白质质方法——抗抗原-抗体体杂交苏云金杆菌Bt毒素蛋蛋白将Bt毒蛋蛋白注射小小鼠体内从小鼠血管管抽出血液液分离出抗抗Bt毒素素的抗体抗体蛋白质出现杂交带带脱分化组织培养（4）除上上述分子检检测外，有有时还需进进行个体生物学学水平的鉴鉴定：如抗抗性特性——检