兔自身免疫性干眼模型制作及检测

兔自身免疫性干眼模型制作及检测第一页，共二十七页，2022年，8月28日兔自身免疫性干眼模型概要通过体外分离、培养兔泪腺上皮细胞和自体外周血淋巴细胞，建立二者的共培养体系。将体外激活的自体外周血淋巴细胞通过耳缘静脉注射的方法诱发自身免疫性泪腺炎。从而建立稳定的兔自身免疫性干眼模型，对干眼临床指标及泪腺细胞因子表达进行检测。第二页，共二十七页，2022年，8月28日兔自身免疫性干眼模型实验动物：成年雌性新西兰白兔，体质量2.6～3.5kg。实验前进行兔子临床眼科检查,排除已患有眼部炎症和其他疾病的动物，建立正常兔眼的临床检查指标的基线水平。饲养环境符合医学实验动物环境的要求，动物饲养房温度为25±2℃，相对湿度50%～75%，12小时光照昼夜循环，通风状况好。第三页，共二十七页，2022年，8月28日兔自身免疫性干眼模型实验所用的主要仪器、设备及材料：生物超净工作台CO2恒温细胞培养箱移液枪-80℃超低温冰箱倒置相差显微镜台式离心机裂隙灯显微镜摄像系统离心管、枪头PCR仪实时定量PCR仪流式细胞仪流式管超纯水装置低温水箱裂隙灯显微镜恒温水浴锅眼科手术器械祸旋仪高压蒸汽消毒器电子天平鼓风式干燥箱磁力搅拌器PH测量计荧光显微镜SY-600恒温水箱Nylon细胞滤网第四页，共二十七页，2022年，8月28日兔自身免疫性干眼模型主要试剂及溶液配制：淋巴细胞培养基（CM）RPMI1640细胞培养基450ml胎牛血清（FBS）10%青链霉素100U/mlL-谷氨酰胺2mM2-mercaptoethano0.5ml泪腺上皮细胞培养基（DMEM）DMEM（1Xhighglucose）450ml胎牛血清（FBS）10%青链霉素100U/mlL-谷氨酰胺2mM第五页，共二十七页，2022年，8月28日兔自身免疫性干眼模型主要试剂及溶液配制：Ham's液Ham'sF-12

1LHepes

10ml/L牛血清蛋白蛋白（BSA）100U/ml胰蛋白酶抑制剂50mg/L丁酸0.22g/L青链霉素100U/mlL-谷氨酰胺2mM亚油酸1mg/ml42ul各组分充分溶解于900mlHam’sF-12后调节PH值至7.4，Ham’sF-12定容至1000ml，0.22μm滤器过滤，4℃冰箱保存备用。第六页，共二十七页，2022年，8月28日兔自身免疫性干眼模型主要试剂及溶液配制：Hank's液HanksSalts

1bottleHepes

2.38gEDTA0.76g各组分充分溶解于900ml超纯水后调节PH值至7.4，超纯水定容至1000mL，0.22μm滤器过滤，4℃冰箱避光保存。混合消化酶（CDH）胶原酶collagenaseⅠ

450unit/ml透明质酸酶hyyaluronidase

200unit/mlDNA酶Ⅰ25unit/ml分别称取计算好的Ⅰ型胶原酶和透明质酸酶，将其充分溶解于一定体积的Ham’s液中，加入溶解分装好的DNA酶充分混匀，0.22μm滤器过滤，4℃冰箱备用。第七页，共二十七页，2022年，8月28日兔自身免疫性干眼模型主要试剂及溶液配制：10%FicollFicoll粉与DPBS按比例配制高压灭菌,分装后-20'C避光保存。实时突光定量PCR试剂盒SYBRGreen(Roche491385001)PE-Anti-HumanFoxp3(Biolegend)Anti-RabbitCD4(Mouseanti-RabbitMonoclonalAntibodyAbD)淋巴细胞分离液无RNA酶水（DEPC水）第八页，共二十七页，2022年，8月28日兔自身免疫性干眼模型实验方法：1、兔泪腺上皮细胞分离、纯化、培养（1）新西兰大白兔肌肉注射陆眠宁和氯胺酮（两者的比例为2:3，0.3-0.4ml/kg）进行麻醉，剪去兔左眼睫毛，将生理盐水和碘伏按1:1稀释，充分清洗术眼结膜囊，再用生理盐水清洗，以免碘伏刺激眼表，后用0.5%盐酸丁卡因滴眼液滴术眼，后用无菌手术器械将麻醉后的兔子在超净台中操作摘取兔左下泪腺,将泪腺转移到提前配置好的装有双抗和Ham’s液的50ml离心管中。（2）在细胞间超净台进行以下操作，将泪腺和少量的Ham’s液放入培养皿中，先剔除泪腺组织周围的血管、脂肪组织和筋膜，无菌刀将腺体切碎至约1mm×1mm的组织块，用移液枪加入Hank’s液后吹打吹散组织块，转移到50ml离心管中倾斜静置15min，弃掉上清。（3）然后再加入Ham’s液吹打均匀倾斜静置15min，小心弃掉上清，以防组织块的丢失。（4）加入配置好的消化酶（胶原酶，透明质酸酶，DNA酶）,磁力搅拌器提前设置好温度和转速，37℃恒温水浴消化10min。第九页，共二十七页，2022年，8月28日兔自身免疫性干眼模型实验方法：1、兔泪腺上皮细胞分离、纯化、培养（5）取出后静置15min，弃掉上清，加入10mlHank’s液反复吹打后静置15min，弃掉上清。（6）再加入配置好剩余的消化酶，37℃水浴消化30min，观察组织块的大小，可适当的增减10min。（7）然后用Ham’s液浸润40μm无菌细胞筛，将其置于50ml离心管上，将稀释后的混合液吹打均匀后过滤，1000rpm离心6min，弃上清。（8）加入20mlHank’s液吹打均匀，离心1000rpm，6min，弃上清，加入5mlHam’s液充分混匀。（9）提前准备质量分数为10%的Ficoll（SigmaFicoll粉与Ham’s液配制），用Ham’s液稀释到2%、3%、4%，从下到上依次为4%、3%、2%各5ml加入50ml离心管中，将细胞悬液缓慢加入到Ficoll液面上，进行密度梯度离心，400rpm离心10min，上下加速度为0。第十页，共二十七页，2022年，8月28日兔自身免疫性干眼模型实验方法：1、兔泪腺上皮细胞分离、纯化、培养（10）离心后，细胞在最底层。弃上清，用PBS缓冲液洗两遍细胞，洗掉杂质和Ficoll，离心结束尽可能弃干净上清。（11）加入DMEM完全培养基（10%FBS+1%双抗+1%谷氨酰胺+DMEM基础培养基），进行细胞计数和细胞活性观察，细胞计数后取一定数量105细胞于100μLPBS内吹打均匀，再加入100μL的台盼蓝，显微镜下观察计数板上细胞染色情况，计录未着染的细胞百分比。（12）将分离的泪腺上皮细胞1.5×105/孔放置24孔板中于37℃、5%CO2、100%饱和湿度的培养箱中培养。第十一页，共二十七页，2022年，8月28日兔自身免疫性干眼模型实验方法：2、兔外周血淋巴细胞分离、培养（1）将新西兰大白兔固定，兔耳中动脉碘伏消毒后用酒精棉球擦拭使其血管扩张，用提前准备的静脉采血针和采血管采血，每只兔预计抽大约20mL的外周血。（2）用提前预热的37℃的PBS缓冲液将外周血稀释3倍后装在50mL离心管中（每管约30ml）。（3）将每管约30ml稀释的外周血缓慢加入到10mL淋巴细胞分离液液面上，离心2000rpm，20min，上下加速度为0。（4）离心后可见离心管中分三层，在上、中间层界面处有一以淋巴细胞为主的白色云雾状狭窄带，这一层细胞即为所需要，吸取收集该层淋巴细胞带放入新的50mL离心管中。（5）加入PBS缓冲液，离心2000rpm，10min,弃上清，再加入PBS缓冲液离心。第十二页，共二十七页，2022年，8月28日兔自身免疫性干眼模型实验方法：2、兔外周血淋巴细胞分离、培养（6）加淋巴细胞培养基（10%FBS+1%双抗+1%谷氨酰胺+RPMI1640培养基+β巯基乙醇），计数，进行细胞计数和细胞活性观察，细胞计数后取一定数量105细胞于100μLPBS内吹打均匀，再加入100μL的台盼蓝，计录未着染的细胞百分比。（7）分别配制与泪腺上皮细胞等密度的细胞液。第十三页，共二十七页，2022年，8月28日兔自身免疫性干眼模型实验方法：3、建立自体细胞混合培养体系泪腺上皮细胞培养于平底24孔板内（1.5x105个/孔），单独培养2d的泪腺上皮细胞，进行γ线照射（剂量为25Gy），使其失去反应能力，成为刺激细胞。载有泪腺上皮细胞的24孔板照完射线后，每孔加入当天分离等数量的外周血淋巴细胞1.5×105个，此时泪腺上皮细胞已贴壁，淋巴细胞为悬浮细胞，加入淋巴细胞时候小心缓慢加入，以防吹起已贴壁的泪腺上皮细胞，建立混合培养体系，培养5天。第十四页，共二十七页，2022年，8月28日兔自身免疫性干眼模型实验方法：4、自身免疫干眼模型的制备（1）实验分组：24只术前检查合格的雌性新西兰大白兔，按照随机数表法给兔子编号，分为2组即正常对照组，干眼模型组。干眼模型组为静脉回输自体激活的外周血淋巴细胞诱导的兔自身免疫性干眼。正常对照组为静脉回输与干眼模型组等体积的PBS缓冲液。（2）干眼模型的制备：将标注好的雌性新西兰白兔固定，预先准备好输液器、5ml、10ml针管、酒精、碘伏，以及预先准备好的淋巴细胞（混合体系混合培养5天，观察发现淋巴细胞较之前体积变大，呈圆形，聚集性分布，周围可见围绕的泪腺上皮细胞，用1ml枪头缓慢吹起落在底部的淋巴细胞，收集到50ml离心管中，在这个过程中在显微镜下观察进来避免吹起贴壁的泪腺上皮细胞，用PBS缓冲液将24孔板洗两遍，2000rpm离心10min，弃掉上清，再用PBS缓冲液洗一遍，之后加1ml的PBS缓冲液计数，吹散细胞，尽可能不要有细胞团块避免栓塞发生的可能，最后按照淋巴细胞2×105每只兔子的数量，每只兔子1ml转移到50ml离心管中放在冰上保持细胞活性，以备使用）。第十五页，共二十七页，2022年，8月28日兔自身免疫性干眼模型实验方法：4、自身免疫干眼模型的制备釆用静脉输液器，预先将PBS充满整个静脉回输装置排空空气预防空气栓塞。通过耳缘静脉回输激活的自体激活的外周血淋巴细胞（2x106/ml，1ml）为干眼模型组，耳缘静脉碘伏消毒后用2ml的注射器推注1mLPBS确保液体进入静脉血管中，然后在接头处换成有细胞液的注射器，注射前保证无细胞沉淀以防栓塞，匀速推注，最后换成装有PBS的注射器，再输入1ml左右的PBS保证细胞完全进入到血管中，以防细胞丢失。静脉回输等量PBS的新西兰白兔为对照组。第十六页，共二十七页，2022年，8月28日兔自身免疫性干眼模型临床指标的检测：移植前和移植后2周、4周、6周分别进行以下临床指标的观察：泪液分泌量实验（Schirmer’sⅠ实验）将兔子固定好，在非表麻条件下，将Schirmer’s试纸条顶端放置于下穹窿结膜中外侧1/3处，检查者辅助闭合兔眼，此时尽量避免兔子第三眼睑遮住角膜以及试纸条，计时1分钟后取出试纸条，记录湿润长度，试验过程中尽量避免试纸条接触角膜，以免造成角膜上皮损伤。泪膜稳定性实验（泪膜破裂时间tearbreak-uptime，BUT）将兔子固定好，眼表滴10μL荧光素液，检查者辅助兔眨眼3次，计时1分钟，检查者辅助打开上下眼睑，检查者用手持裂隙灯，在钴蓝光下观察角膜表面泪膜破裂时间以及泪河高度，重复三次取平均值。角膜、结膜荧光素钠染色实验将兔子固定好，复方托比卡按散瞳，等待大约十分钟，等其瞳孔完全散开后，眼表滴10μL荧光素液，计时1分钟，使荧光素液均匀平铺于眼表，检查者辅助打开上下眼睑，将裂隙灯下调至钴蓝光，观察角膜、结膜的着染情况并拍照记录。第十七页，共二十七页，2022年，8月28日兔自身免疫性干眼模型组织病理学观察：分别于移植后6周从各组中新西兰大白兔注射戊巴比妥钠（56mg/kg）处死兔子，分离上下泪腺、结膜、角膜置于10%甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋，HE染色后观察浸润细胞的情况。（1）取泪腺、结膜等组织块，用10%甲醛溶液固定，固定后常规石蜡包埋，切片。（2）石蜡包埋切片后用二甲苯脱蜡，二甲苯I、二甲苯Ⅱ各5min，100％乙醇、2min，95％的乙醇、1min，80％乙醇、75％的乙醇各1min，蒸馏水洗2min。（3）苏木素染色5min后冲洗。（4）1%盐酸乙醇浸泡30s（数下）。（5）自来水浸泡15min。（6）伊红液染色2min。（7）常规脱水，95％乙醇I、1min，95％乙醇Ⅱ、1min，100％乙醇I、1min，100％乙醇Ⅱ、1min，二甲苯石碳酸（3：1）1min，二甲苯透明，二甲苯I、1min，二甲苯Ⅱ、1min。（8）中性树脂封片固定。第十八页，共二十七页，2022年，8月28日兔自身免疫性干眼模型泪腺组织RNA的提取：（1）分别于移植后6周将各组中新西兰大白兔注射戊巴比妥钠（56mg/kg）处死兔子，收集上、下泪腺、结膜、角膜组织，将泪腺组织剪至1cm的组织块装于1.5mlEP管中，迅速放于液氮后转移到-80℃的冰箱中。（2）将所提RNA组织找到放到液氮瓶中，现将研钵和研棒提前一天84液浸泡，提前2小时18.2纯水浸泡，用卫生纸擦干后先用液氮降温，待研钵中的液氮稳定后，将组织块在液氮中研磨，保证充足的液氮，将组织块研磨成粉末后，加入1ml的Trizol后转移到1.5ml的EP管中，充分吹打。（3）再按每1mlTrizol加入0.2ml比例的氯仿，盖紧盖子，用力上下剧烈摇晃15秒，呈粉色混合物。（4）常温静置15min，4℃离心机12000rpm离心15min，离心后可见EP管内分为三层，最上层为上清液，中间一层为白色膜状物，最底层为红色沉淀物。（5）将上清转移至另一新的标记好的1.5mL进口EP管中，再加入等体积的异丙醇，室温静置10min，4℃离心机12000rpm离心10min。第十九页，共二十七页，2022年，8月28日兔自身免疫性干眼模型泪腺组织RNA的提取：（6）弃掉上清，加入1ml的75%乙醇（提前配置：750uL无水乙醇+250uLDEPC水），倒置上下摇晃几次，4℃离心机10000rpm离心5min。（7）观察管底，避免枪头碰到管底，弃掉上清，打开管盖干燥10min。（8）随后将RNA溶于20uL的DEPC水中，置于冰上，混匀后取1μL在NanoDropND-100上测RNA浓度，测三次，取其均值，记录标注好并将RNA-保存在80℃冰箱中。第二十页，共二十七页，2022年，8月28日兔自身免疫性干眼模型泪腺组织RNA逆转录：（1）将保存于-80℃的所需的RNA置于冰上待其溶解，根据标注好所测的浓度按照1μgRNA，20μl体系逆转录，计算出不同RNA所加的体积。（2）先将RNA所在EP管涡旋离心，将标记好的EP管分别加入计算好体积的RNA，Oligo(dT)1μl,DEPC水补到12μl，涡旋离心后置于冰上待用。（3）用ThermoPCR仪，提前设置好温度时间，待PCR仪机器盖子温度升高后放入样本，65℃5min。（4）取出样本置于冰上，每个样本按顺序加入5×Reactionbuffer4μlInhibitor1μlTranscriptase1μl10MmdNTPMix2μl（5）涡旋离心混匀后，待PCR仪机器盖子温度升高到40℃后放入各样本，42℃60分钟，70℃5分钟，待反应结束后即EP管中的为逆转录生成的cDNA，将其逆转录产物cDNA置于冰上，然后用DEPC水稀释10倍，涡旋离心混匀后置于-80℃冰箱保存。第二十一页，共二十七页，2022年，8月28日兔自身免疫性干眼模型实时定量PCR（quantitativereal-timePCR）RT-PCR：反应原理:使用美国AppliedBiosystems公司的实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）仪分析应用AppliedBiosystems7900HTFastReal-timePCRSystem，SYBRGreen法，使用FastSYBR@GreenMasterMix。在PCR反应过程中SYBRGreen荧光染料掺入DNA双链后发射荧光信号，而不掺入DNA双链的SYBR荧光染料不会有荧光信号，所以SYBRGreen荧光信号与DNA扩增产物的增加一致。双链DNA在变性过程中解开呈单链，没有荧光,在形成双链DNA的复性和延伸过程中,SYBRGreen发出荧光，此阶段PCR仪器釆集荧光信号。利用此信号的变化对PCR扩增反应中扩增产物扩增量的变化进行检测，用循环数对基因定量分析。GAPDH将作为反应内在参照,用内参对所检测样品所含的DNA进行定量分析的方法。相对定量结果分析采用比较荧光强度达阈值时的循环数(Ct)值法（2-ΔΔCt法），扩增的倍数=2-ΔΔCt，ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct内参）实验组-（Ct目的基因-Ct内参）对照组。各指标均重复检测3次，取平均值。本实验通过实时定量PCR检测泪腺组织中Th1、Th17、Treg细胞分化相关细胞因子及转录因子mRNA相对表达量。第二十二页，共二十七页，2022年，8月28日兔自身免疫性干眼模型实时定量PCR（quantitativereal-timePCR）RT-PCR：所测基因上下游引物序列如下：GAPDHForwardprimerGGGTGGTGGACCTCATGGTReverseprimerCGGTGGTTTGAGGGCTCTTAIFN-γForwardprimerCTCTGCCTCATCTTGGGTTCTTReverseprimerGGTGTTCTGTTTCTCTGGTTAGTGTGTIL-10ForwardprimerGGCTGAGGCTGCGACAATReverseprimerTGCCTTGCTCTTGTTTTCACATGF-βForwardprimerCAAGGACCTGGGCTGGAAReverseprimerAGGCAGAAGTTGGCGTGGTAIL-6ForwardprimerGCAGAAAAACCAGTGGCTGAAReverseprimerGGCCGCGCAGGATGAIL-17ForwardprimerGGAATGAGGACCACCACATGAReverseprimerCTGCGTAGGACCAGGATCTCTTTNF-αForwardprimerAGCTTCTCGGGCCCTGAGTReverseprimerCCACTTGCGGGTTTGCTACTT-betForwardprimerGATGCGCCAGGAAGTTTCAReverseprimerTGTTGGAGGCCCCTTTATTGRORrtForwardprimerGGCCTACCACGCCGAReverseprimerTCCATGCCACCGTATTTGC第二十三页，共二十七页，2022年，8月28日兔自身免疫性干眼模型实时定量PCR（quantitativereal-timePCR）RT-PCR：（1）从-20℃冰箱中取出引物，置于冰上待其完全溶解，先配置100uM浓度的，混合均匀，随后分装稀释到4uM浓度的引物。（2）从-20℃冰箱中取出FastSYBRGreenMasterMix，置于冰上避光待其完全溶解待用。（3）从-80℃冰箱中取出cDNA置于冰上待其完全溶解，溶解后混均匀。（4）8ul反应体系包括:SYBRGreen4ul上游引物（4uM）lul下游引物（4uM）lulcDNA2ul提前配置好SYBRGreen和上下游引物的混合液，计算好所需的cDNA的量，384孔板中每孔先加入SYBRGreen和上下游引物的混合液，再根据样本所检测加入cDNA。第二十四页，共二十七页，2022年，8月28日兔自身免疫性干眼模型实时定量PCR（quantitativereal-timePCR）RT-PCR：（5）配制混合液和384孔板的上样操作过程均需避光进行，加样结束后，384孔板封膜。（6）先将384孔板置于祸旋器涡旋lO秒，使其反应体系充分混合均匀。（7）提前预冷离心机，再将384孔板置于离心机4000rpm，4min离心。（8）再将384孔板放入AppliedBiosystems7900HTFastRea1-TimePCR仪,做好标