免疫学检测技术的基本原理及其应用

免疫学检测技术的基本原理及其应用第一页，共四十二页，2022年，8月28日提要免疫学检测技术主要应用：对多种免疫性疾病的诊断、疗效评估、发病机制探讨;对抗原性物质、免疫细胞、细胞因子、粘附分子或细胞受体等的定性、定量检测。第二页，共四十二页，2022年，8月28日第一节抗原或抗体的检测抗原-抗体反应包括：沉淀反应、凝集反应、溶解反应、补体结合反应、中和反应等。抗原-抗体反应可用已知的特异性抗体检测未知的抗原；也可用已知的抗原检测未知的抗体。第三页，共四十二页，2022年，8月28日第一节抗原或抗体的检测免疫标记技术包括：免疫酶技术、免疫荧光技术、同位素标记技术、化学发光免疫技术、免疫胶体金技术等。第四页，共四十二页，2022年，8月28日抗原-抗体反应的特点：P226抗原-抗体的特异性结合。抗原抗体分子表面的非共价键结合。反应的两个阶段：特异性结合阶段；可见的反应阶段。是否呈现可见的反应现象，与抗原和抗体两者的分子浓度和比例密切相关。第五页，共四十二页，2022年，8月28日抗原抗体比例对反应现象的影响第六页，共四十二页，2022年，8月28日抗原-抗体反应的影响因素1.电解质：抗原-抗体反应通常应用0.85%的氯化钠（适当浓度的电解质）作为稀释液。2.温度：反应常在37℃水浴或孵育箱中进行。3.酸碱度：抗原-抗体反应适应的酸碱度

为PH6-8。抗原-抗体反应受多种因素影响第七页，共四十二页，2022年，8月28日抗原抗体的检测方法凝集反应沉淀反应中和反应用标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应第八页，共四十二页，2022年，8月28日凝集反应

(Agglutination)

细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合、凝集的现象。1、直接凝集：将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为玻片法（定性试验）和试管法（半定量试验）。第九页，共四十二页，2022年，8月28日凝集反应

(Agglutination)2、间接凝集：将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面，形成致敏颗粒，与相应抗体反应出现的颗粒凝集现象。第十页，共四十二页，2022年，8月28日血球凝集第十一页，共四十二页，2022年，8月28日沉淀反应

（Precipitation)

血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物，称为沉淀反应。第十二页，共四十二页，2022年，8月28日沉淀反应

（Precipitation)沉淀反应可在液体中进行，如絮状沉淀。大多数沉淀反应是用半固体琼脂凝胶为介质，进行琼脂扩散故也称免疫扩散。第十三页，共四十二页，2022年，8月28日单向免疫扩散

(SingleImmunodiffusion)将一定量已知抗体混于琼脂凝胶中制琼脂板；打孔，将抗原加入孔中扩散。抗原与抗体相遇，形成沉淀环，环的直径与抗原含量成正比。常用于测定血清IgG、IgM、IgA和C3等的含量。含抗体的凝胶沉淀环第十四页，共四十二页，2022年，8月28日双向免疫扩散

（DoubleImmunodiffusion)将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者自由扩散并相遇，在比例合适处形成沉淀线。含两种以上的抗原抗体系统，可出现两条以上的沉淀线。常用于抗原或抗体的定性、组成和两种抗原相关性分析的检测。第十五页，共四十二页，2022年，8月28日免疫电泳

（Immunoelectrophoresis)将待测血清标本作琼脂凝胶电泳，不同分子量蛋白组分开，然后与电泳方向平行挖一小槽，加入相应的抗血清，与不同区带的蛋白抗原作双向免疫扩散，在各区带相应的位置形成沉淀弧。常用于血清蛋白种类分析。第十六页，共四十二页，2022年，8月28日火箭电泳（RocketElectrophoresis)

也称免疫扩散，是把单向免疫扩散同电泳结合在一起的方法。抗原在含有定量抗体的琼脂中泳动，两者比例适宜时，在较短时间内生成锥形的沉淀峰。在一定浓度范围内，沉淀峰的高度与抗原含量成正比。特点：需时较短，用于快速沉淀标本中抗原含量的测定。第十七页，共四十二页，2022年，8月28日火箭电泳示意图第十八页，共四十二页，2022年，8月28日免疫标记技术

用荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。能极大地提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性或定位检测。三种基本类型：免疫荧光技术、免疫酶技术和同位素标记技术。第十九页，共四十二页，2022年，8月28日免疫荧光显微技术

(ImmunofluorescenceTechnique)

将荧光素（异硫氰酸荧光素，FITC、藻红蛋白，PE)与抗体连接成荧光抗体，再与待测标本的抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发出荧光，对标本中抗原的鉴定和定位。包括直接荧光法、间接荧光法和补体法。第二十页，共四十二页，2022年，8月28日直接荧光法：将荧光素直接标记抗体作标本染色。优点：是特异性强。缺点：每检测一种抗原必须制备相应的荧光抗体。间接荧光法：用一抗与标本中的抗原结合，再用荧光素标记的二抗染色。优点：敏感性比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗可用于多种抗原的检测。第二十一页，共四十二页，2022年，8月28日补体结合免疫荧光法：在间接法的第一步抗原-抗体反应时加入补体，使之与抗原-抗体复合物结合；再用荧光素标记的抗C3抗体进行示踪。第二十二页，共四十二页，2022年，8月28日间接免疫荧光法示意图第二十三页，共四十二页，2022年，8月28日免疫荧光显微技术第二十四页，共四十二页，2022年，8月28日流式细胞术（FlowCytometry,FCM)

FCM是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞的表面标志（抗原或受体）进行快速、精确的分析和自动检测，并将不同类型的细胞分选收集。FCM还可对同一细胞的多种参数（如DNA、RNA、蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析。流式细胞术第二十五页，共四十二页，2022年，8月28日流式细胞仪工作原理第二十六页，共四十二页，2022年，8月28日酶免疫测定

(EnzymeImmunoassay,EIA)用酶（常用辣根过氧化物酶，即HRP或碱性磷酸酶，即ALP)标记的抗体与相应抗原反应。通过酶作用于底物后显色来判定结果。常用的方法有酶联免疫吸附试验和酶免疫组化法，前者测定可溶性抗原或抗体，后者测定组织中或细胞表面的抗原。第二十七页，共四十二页，2022年，8月28日酶联免疫吸附试验

(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA)是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。用洗涤法将液相中游离成分洗除。主要有双抗体夹心法、间接法等。第二十八页，共四十二页，2022年，8月28日

ELISA检测抗体第二十九页，共四十二页，2022年，8月28日第三十页，共四十二页，2022年，8月28日放射免疫测定法

(Radioimmunoassay,RIA)用放射性核素标记抗原进行的免疫学检测技术。放射性核素显示的高灵敏性，使检测的敏感性达pg水平。常用于标记的放射性核素有I125和I131。常用于胰岛素、生长激素、药物等微量物质的测定。第三十一页，共四十二页，2022年，8月28日免疫印迹法（Immunoblotting）将凝胶电泳与固相免疫测定结合，先把电泳分区的蛋白质转移到固相载体，再用酶免疫、放射免疫等技术测定。能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量。常用于检测多种病毒（如HIV）的抗体或抗原。第三十二页，共四十二页，2022年，8月28日免疫印迹法示意图第三十三页，共四十二页，2022年，8月28日第三节免疫细胞的检测

检测各种淋巴细胞的数量与功能是观察机体免疫状态的重要手段。外周血是病人主要的检测标本，但仅代表再循环的淋巴细胞。实验动物还可取胸腺、脾、淋巴结等作为标本进行检查。第三十四页，共四十二页，2022年，8月28日(1)抗凝静脉血(2)加等量NS(4)密度梯度离心血浆分离液RBCPBMCPMN(3)混匀后，缓慢加于分离液上第三十五页，共四十二页，2022年，8月28日T细胞功能测定体外法：T细胞增殖试验形态学检查

3H-TdR掺入法

MTT法体内法：用生物抗原或化学抗原作皮内试验。OT-PPD皮试

第三十六页，共四十二页，2022年，8月28日培养液3H-TdRPHA淋巴细胞全血分层液离心过滤测量放射性淋巴细胞增殖试验（3H-TdR掺入法）示意图第三十七页，共四十二页，2022年，8月28日靶细胞51Cr洗涤去除游离的51Cr效应细胞测量上清液中释放的51Cr混合培养4-6小时细胞毒试验（51Cr释放法）示意图：（Na51CrO4标记靶细胞）第三十八页，共四十二页，2022年，8月28日细胞毒试验（乳酸脱氢酶释放法）

正常情况下，乳酸脱氢酶（LDH）存在于细胞内，细胞损伤时，细胞膜通透性增加，LDH释放，酶促显色反应。第三十九页，共四十二页，2022年，8月28日酶联免疫斑点法

（Enzyme-LinkedImmunospot,ELISPOT)在ELISA的基础上建立的检测抗体生成细胞及细胞因子产生细胞的方法。第四十页，共四十二页，2022年，8月28日CK抗体包被的反应板

CK抗原包被的反应板加入淋巴细胞加入酶标记二抗加入