第11章生物素亲合素放大技术

会计学1第11章生物素亲合素放大技术生物素（biotin,B）是一种小分子生长因子,又称维生素H或辅酶R动、植物组织中广泛分布,卵黄和肝含量高MW244.31kD.I环为咪唑酮环，可与亲合素结合Ⅱ环为噻吩环，C2上戊酸侧链的未端羧基是结合生物大分子的唯一结构

I咪唑酮环

Ⅱ噻吩环

羧基第一节生物素理化性质与标记第1页/共49页一、活化生物素生物素侧链的末端羧基经化学修饰后制成带各种活性基团的衍生物－活化生物素(生物素化衍生物)第2页/共49页生物素活化活化生物素易与抗原、抗体酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标记物标记蛋白质氨基的活化生物素标记蛋白质醛基的活化生物素标记蛋白质巯基的活化生物素标记核酸的活化生物素第3页/共49页CNHNHCHCH2CHCHOS(CH2)4COOHNH2COCH2CH2CONHOHCOONCOOCCH2CH2EDC标记蛋白质氨基的活化生物素生物素N-羟基丁二酰胺碳二亚胺生物素羟基琥珀酰亚胺酯（BNHS）第4页/共49页活化生物素BNHS分子可与蛋白质赖氨酸的氨基形成肽键BNHS适用标记抗体和中性或偏碱性的蛋白质如何减小空间位阻？长臂活化生物素（BCNHS）：生物素和N-羟基丁二酰亚胺之间添加了两个6-氨基已糖分子基团，形成连结臂，生物素与大分子基团的距离第5页/共49页标记蛋白质醛基的活化生物素生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物主要用于标记偏酸性糖蛋白肼化生物胞素(BCHZ)

：生物素与赖氨酸连接后，再与无水肼反应而成。除醛基外，BCHZ还可标记氨基第6页/共49页标记蛋白质巯基的活化生物素马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB)能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素第7页/共49页标记核酸的活化生物素光敏生物素(photobiotin)

侧链上连接的芳香基叠氮物基团,经光照后,变为芳香基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结合,形成B-核酸探针

N3NO2NH(CH2)3N(CH2)3CH3NHC(CH2)4SNHNHO第8页/共49页生物素脱氧核苷三磷酸（Bio-dUTP）

作为TTP的结构类似物，可采用缺口移位法掺入到双链DNA中。BNHS和BHZ

可直接标记核酸，但对碱基配对有影响。第9页/共49页活化生物素通过侧链与蛋白分子连接；一个蛋白分子可被多个生物素标记－多价性；对BNHS多标记抗体,BHZ则多标记微酸性抗原；抗原、抗体标记后活性不变；可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标记后活性将降低；二、生物素标记蛋白质第10页/共49页选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；控制生物素：蛋白质比例生物素：IgG用量比(mg/mg)宜为2:1,IgG应用浓度

0.5~5μg/ml;

生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab；使用交联臂减少空间阻力第11页/共49页第二节亲合素、链霉亲合素的理化性质与标记

亲合素(avidin,AV)和链霉亲合素(streptavidin,SA)是生物素的天然特异性结合物。而且，二者均为大分子蛋白，因此几乎所有用于标记的物质均可以同亲合素（AV）或链酶亲合素（SA）结合。第12页/共49页结构

四亚基糖蛋白四肽链蛋白无糖基PI

10.56结合位

色氨酸色氨酸生物素

44Ka

10151015活性

13～1515～18亲合素（A）链霉亲合素(SA)一、理化特性第13页/共49页二、亲合素/链霉亲合素标记标记物：小分子示踪物125I、胶体金、荧光素、化学发光物大分子物质如酶抗原、抗体亲和素的标记：HRP的标记改良过碘酸钠法戊二醛法第14页/共49页过碘酸盐氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+NH2AvidinOOONNAvidinAvidinH2ONAvdinNaBH4Schiff碱酶-五炭糖环第15页/共49页戊二醛法酶－NH2亲和素－NH2＋(CH2)3CHOCHO(CH2)3CHN酶CHN亲和素第16页/共49页B-E+AABC2.亲和素－生物素化HRP复合物的制备第17页/共49页链霉亲和素的标记方法：过碘酸钠法HRP+NaIO4+SA透析+KBH4

沉淀第18页/共49页过碘酸盐氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+NH2SAvidinOOONNSAvidinSAvidinH2ONAvdinKBH4Schiff碱酶-五炭糖环第19页/共49页第三节生物素-亲合素系统的特点一、灵敏度高二、特异性强三、稳定性好四、适用性广五、其他第20页/共49页第四节生物素-亲合素系统的应用生物素与亲合素之间结合的亲合力高、特异性强，各自均可以与各型大小分子结合，以及二者在结合反应时具有的多级放大作用等优越性，使BAS及其相关技术被广泛应用在各种标记免疫分析技术领域中，尤其为标记免疫检测自动化分析做出了极大的贡献。

第21页/共49页一、生物素-亲合素系统基本类型及原理BAB法：

Ag+B·AbAg-Ab·BAAg-Ab·B-AB·EAg-Ab·B-A-B·E

特点：以游离A分别连接B-Ab和B-E第22页/共49页+A+A第23页/共49页ABC法⑴A+B·EA-B·E----ABC⑵Ag+B·AbAg-Ab·BABCAg-Ab·B-ABC特点:将BAB法中的A先与B-E结合，制备成复合物ABC第24页/共49页++ABCB-E+AABCAb-Ag-Ab-B+ABCAb-Ag-Ab-B-ABC第25页/共49页BA法Ag+B·AbAg-Ab·BA·EAg-Ab·B-A·E特点：以A-E/SA-E代替BAB法中的A，省却了加B-E的步骤第26页/共49页

Ag-Ab1-Ab2-B+A-EAg-Ab1-Ab2-B-A-E+A-E第27页/共49页BAS实验方法及反应层次方法反应层次直接法BAAg-(Ab-B)-A*BABAg-(Ab-B)-A-B*ABCAg-(Ab-B)-AB*C间接法BAAg-Ab1-(Ab2-B)-A*BABAg-Ab1-(Ab2-B)-A-B*ABCAg-Ab1-(Ab2-B)-AB*C第28页/共49页二、生物素-亲合素系统在酶免疫测定中的应用BAS在ELISA中的应用生物素-亲合素系统在均相酶免疫测定

第29页/共49页AB固相化抗原或抗体BY第30页/共49页电化学发光免疫测定示意图第31页/共49页用于终反应的放大第32页/共49页三、生物素-亲合素系统在荧光免疫技术中的应用BAS用于荧光抗体技术，通常采用BA法，即用荧光素直接标记亲合素（或链酶亲合素）；也可采用游离亲合素（或链酶亲合素）搭桥，两端分别连接生物素化抗体和荧光素标记的生物素（BAB法）或荧光标记的抗亲合素（或链酶亲合素）抗体的夹心法。

第33页/共49页四、生物素-亲合素系统在放射免疫测定中的应用BAS主要与免疫放射分析(IRMA)检测体系偶联，用于对终反应的放大（BA法）BAS也可用于IRMA反应后B、F成分的分离第34页/共49页五、生物素-亲合素系统在分子生物学中的应用以生物素标记核酸探针进行的定位检测用BAS制备的亲和吸附剂进行基因的分离纯化将免疫测定技术与PCR结合建立免疫-PCR(immuno-PCR)用于抗原的检测第35页/共49页Anti-HCVSandwichprinciple.Totalduration:18minutes.1stincubation:40μLofsample,60μLofreagentcontainingbiotinylatedHCVantigensand60μLofareagentcontainingHCVantigenslabeledwitharutheniumcomplexreacttoformasandwichcomplex.2ndincubation:Afteradditionofstrepetavidin-coatedmicroparticles,thecomplexbecomesboundtothesolidphaseviainteractionofbiontinandstreptavidin.第36页/共49页Thereactionmixtureisaspiratedintothemeasuringcellwherethemicroparticlesaremagneticallycapturedontothesurfaceoftheelectrode.UnboundsubstancesarethenremovedwithProCell.Applicationofavoltagetotheelectrodetheninduceschemiluminescentemissionwhichismeasuredbyaphotomultiplier.ResultsaredeterminedautomaticallybytheElecsyssoftwarebycomparingtheelectrochemiluminescencesignalobtainedfromthesamplewiththecutoffvalueobtainedbyanti-HCVcalibration.第37页/共49页HBsAgIISandwichprinciple.Totaldurationofassay:18minutes.1stincubation:50μLofsample,twobiotinylatedmonoclonalanti-HBsAgantibodies,andamixtureofmonoclonalanti-HBsAgantibodyandpolyclonalanti-HBsAgantibodieslabeledwitharutheniumcomplexformasandwichcomplex.2nd:incubation:Afteradditionofstreptavidin-coatedmicroparticles,thecomplexbecomesboundtothesolidphaseviainteractionofbiotinandstreptavidin.第38页/共49页Anti-HBeCompetitionprinciple.1st:incubation:Anti-HBeinthesample(35μL)bindstotheaddedHBeAg.2ndincubation:Afteradditionofbiotinylatedantibodiesandrutheniumcomplex-labeledantibodiesspecificforHBeAg,togetherwithstreptavdin-coatedmicroparticles,thestill-freebindingsitesontheHBe-antigensbecomeoccupied.Theentirecomplexisthenboundtothesolidphaseviainteractionofbiotinandstreptavdin.第39页/共49页Anti-HAVIgMμ-Capturetestprinciple.Totaldurationofassay:18minutes.1stincubation:Pretreatmentof10μLoftheautomatically1:400dilutedsample(usingElecsysDiluentUniversal)withanti-Fdyreagenttoblockspecificinthepresenceofthemonoclonalanti-HAVantibodieslabeledwithrutheniumcomplex.第40页/共49页2ndincubation:Afteraddionofbiotinylatedmonoclonalh-IgM-specificantibodies,HAVantigen,andstreptavdin-coatedmicroparticles,theanti-HAVIgMantibodiespresentinthesampleformasandwichcomplexwiththeHAVantigenandtheruthenium-labeledanti-HAVantibodywhichbecomesboundtothesolidphaseviainteractionofbiotinandstreptavidin.第41页/共49页Anti-HBsSandwichprinciple.1stincubation:Anti-HBsinthesample(40L),biotinylatedHBsAg(ad/ay),andHBsAg(ad/ay)labeledwitharutheniumcomplexreacttoformasandwichcoplex.2ndincubation:Afteradditionofstrepavdin-coatedmicroparticles,thecomplesbecomesboundtothesolidphaseviainteractionofbiotinan