大二下-微免实验孙子须

微生物学与免疫学试验（二）严沁

大吞噬实验（单核巨噬细胞对大颗粒异物的吞噬）小吞噬实验（中性粒细胞对小颗粒异物的吞噬）

1、天然免疫/固有免疫/非特异性免疫：①解剖学屏障结构：皮肤、黏膜、胃酸……②固有免疫细胞：吞噬细胞、DC、NK细胞……③固有免疫分子：补体、细胞因子……2、获得性免疫/适应性免疫/特异性免疫:①T淋巴细胞——细胞免疫②B淋巴细胞——体液免疫免疫应答实验内容示教/录像：淋巴细胞转化实验、E花环形成实验示教：沉淀反应——单向琼脂扩散、火箭电泳、

双向琼脂扩散操作：沉淀反应——对流免疫电泳操作：凝集反应——玻片凝集反应一、淋巴细胞转化试验

——

示教、录像有丝分裂原缩写淋巴细胞增殖反应T淋巴细胞B淋巴细胞植物血凝素PHA++-刀豆蛋白AConA++-葡萄球菌A蛋白SPA-+美洲商陆PWM+++检测人外周血T淋巴细胞功能的体外试验。一、淋巴细胞转化试验

——

示教、录像原理：利用人外周血T淋巴细胞表面的有丝分裂原受体与相应丝裂原在体外结合后，可使细胞转化为淋巴母细胞，表现为体积增大、胞浆丰富、并能进行有丝分裂。根据其转化的程度和转化率，可测定机体的细胞免疫功能状态。正常人淋巴细胞转化率约为70％。分型：（1）小淋巴细胞：核质密、胞浆少、无核仁（2）过渡型：比小淋巴细胞略大、核质略疏松，有核仁（3）淋巴母细胞：大4～5倍，核质疏松，核仁1～3个，核周淡染的透明区，胞浆网状可见空泡（4）分裂相：染色体型一、淋巴细胞转化试验

——

示教、录像二、E花环形成试验

——

示教、录像检测人类外周血T细胞数量的一种体外试验方法原理：利用人类T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞受体，可非特异性吸附绵羊红细胞。显微镜下可见以T细胞为中心，周围环绕绵羊红细胞，形似花环，即为E花环。一个E花环形成细胞即为一个T细胞。正常人外周血中E花环形成细胞约占淋巴细胞总数的60％～80％。血清学反应

一、概念

血清学反应（serologicreactions）是指相应的抗原和抗体在体外进行的结合反应。由于抗体主要存在于血清中，进行这类反应时一般都要用含有抗体的血清作为实验材料，所以把体外的抗原、抗体反应称为血清学反应。

二、一般特点：特异性、可逆性、可见性

三、影响因素：浓度、比例、电解质、

温度、酸碱度

四、基本类型

（一）沉淀反应：环状沉淀、絮状沉淀、琼脂扩散、

免疫电泳

（二）凝集反应：直接凝集反应、间接凝集反应

（三）补体结合试验

（四）中和反应

（五）免疫标记技术

血清学反应沉淀反应（precipitationtest）

一、概念

可溶性抗原（如血清、毒素、细菌渗出液等）与相应抗体结合，在有适量电解质存在下，若二者比例适当，经过一定时间形成肉眼可见的沉淀物或沉淀线，称为沉淀反应。

二、重要的沉淀反应试验

1、单向琼脂扩散

2、火箭电泳

3、双向琼脂扩散

4、对流免疫电泳

}}定量定性单向琼脂扩散

（singleagardiffusion）

将一定量已知抗体混于琼脂中，制板，在适当位置打孔，将抗原加入孔中向四周自由扩散，与板中抗体相遇，在比例合适处呈现白色沉淀环，环的直径与抗原含量成正比。

单向琼脂扩散试验是一种定量试验，主要用于测定血清各种Ig和补体成分的含量

。火箭电泳

（rocketelectrophoresis）

将一定量已知抗体混于琼脂中，制板，在板的一端打一排小孔，加入待检样品，置于阴极端进行电泳。抗原在泳动过程中，与抗体在比例合适部位形成锥形沉淀峰，状如火箭，称火箭电泳，又称为单向定量免疫电泳。沉淀峰的高低与抗原的浓度成正比。

本法敏感度与单扩相仿，但需时较短。

双向琼脂扩散

（doubleagardiffusion）

在琼脂板上打孔，抗原和抗体分别加到相应孔中，二者自由向四周扩散，在比例合适处形成沉淀线。若同时含有若干对抗原抗体系统，可出现多条沉淀线。

双向琼脂扩散是一种定性试验，可用于分析和鉴定标本中多种未知抗原成分，也可用已知抗原检测未知抗体。双向琼脂扩散

（doubleagardiffusion）三、对流免疫电泳(counterimmunoelectrophoresis)

——

操作一、原理：抗原抗体在一定的pH溶液中带有电荷，在电场的作用下可发生定向移动。将抗原抗体加入pH8.6的琼脂凝胶中，抗体只带有微弱的负电荷，而且它的分子量又较大，所以泳动慢。更重要的是抗体分子受电渗作用影响较大，也就是说电渗作用大于它本身的迁移率。在电泳时，抗体不但不能抵抗电渗用向正极移动，反而向负极倒退。而一般抗原蛋白带负电荷，将抗原置于负极，将抗体置于正极，电泳后则在两孔之间相遇，并在比例适当的部位形成肉眼可见的沉淀线。

二、操作1、材料琼脂板1块/2人，打孔器2个/组抗AFP血清——已知AbAFP阳性血清——阳性Ag对照阴性血清——阴性Ag待检血清：标本1——未知Ag

标本2——未知Ag三、对流免疫电泳(counterimmunoelectrophoresis)

——

操作2、方法－＋AgAbAgAb>1.5cm>1.5cm阴性阳性标1阴性标2阳性1、制板：用吸管吸取溶化的琼脂加于载玻片上，约3.5mm（已备）2、打孔：用金属打孔器打两排孔，Ag孔与Ab孔间距离为4~5mm3、加样：将抗AFP血清加入Ab孔内，将AFP阳性血清、对照阴性血清、待检血清1和2分别加入相应Ag孔内。（如图所示）*注意：每孔约加入10ul，加样时切勿溢出孔外！4、电泳：将加好样品的琼脂板置电泳槽上，Ag孔置阴极端，Ab孔置阳极端。5、关闭电源，取出琼脂板，观察结果4mm4mm3、结果：在相应Ag、Ab孔间可见白色沉淀线。*记录观察结果后，请将琼脂板上琼脂刮入固体垃圾盆，统一放入前面的瓷缸里！三、对流免疫电泳(counterimmunoelectrophoresis)

——

操作

凝集反应（agglutinationtest）一、概念：

颗粒性抗原（完整的病原微生物或红细胞等）与相应抗体结合，在有电解质存在的条件下，经过一定时间，出现肉眼可见的凝集小块。参与凝集反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。二、类型直接凝集反应：颗粒性抗原+抗体玻片法：定性（操作）试管法：半定量间接凝集反应：可溶性抗原/抗体+微球载体（与免疫无关）

颗粒性抗原+抗体/抗原{↓四、直接凝集反应——玻片凝集

——

操作材料：玻片1张/1人，1号、2号菌，抗痢疾杆菌诊断血清方法：取生理盐水4-5环，加入血清4-5环，刮取少许菌苔混匀

轻摇玻片，1～2分钟后观察结果判定：出现乳白色凝集块为阳性反应*玻片扔进水池旁台上的玻璃缸里！

实验结束后泡手消毒！1号菌液＋诊断血清2号菌液＋诊断血清1、示教：作图（淋巴细胞转化实验、E花环形成实验、单向琼脂扩散、双向琼脂扩散、火箭电泳）2、操作：步骤、作图、结果分析（对流免疫电泳、玻片凝集反