遗传学诊断在遗传性耳聋中的应用,医学遗传学论文

遗传学诊断在遗传性耳聋中的应用,医学遗传学论文内容摘要：1990年运用胚胎移植前遗传学诊断技术(Pre-implantationGeneticDiagnosis,PGD)的首例女婴的成功诞生[1],标志着PGD正式从实验室转化到临床应用。PGD是采用辅助生殖医学方式方法,通过遗传学的诊断技术,挑选健康的胚胎进行子宫移植,它能够对携带遗传性致病基因的夫妇或者患者夫妇进行孕前诊断,进而获得表型正常的后代,且避免因产前诊断为致病胚胎而带来的能否选择终止妊娠的痛苦及反复流产对孕妇的心身伤害。当前PGD已广泛运用于单基因遗传性疾病和染色体异常性疾病。近20多年来,随着辅助生殖技术和胚胎检测技术的飞跃发展,PGD已应用于近200种单基因遗传性病,包括一些特殊单基因遗传性疾病的人类白细胞抗原配型,遗传性癌症和线粒体疾病等。遗传性耳聋绝大部分为单基因变异,具有PGD适应症。随着新一代测序技术广泛应用,胚胎诊断技术准确性及效率均有很大提高。本文通过文献温习,综述PGD的新进展以及其在遗传性耳聋疾病的应用。本文关键词语：胚胎移植,遗传学应用,遗传性耳聋,应用1PGD应用范畴1.1单基因遗传性疾病单基因遗传性疾病即孟德尔遗传病,是根据孟德尔方式传递的疾病,一般由一对等位基因控制单个基因突变引起,牵涉单个核苷酸改变到整个基因改变。单基因遗传性疾病致病单基因及致病突变点确实定,是PGD的基础。根据欧洲人类生殖和胚胎学协会(theEuropeanSocietyofHumanReproductionandEmbryology,ESHRE)-PGD协作组2020年[2]发表的运用于PGD的单基因遗传性疾病谱:当前有近200种单基因遗传性疾病已采用PGD的方式方法来避免垂直传递,华而不实-地中海贫血(beta-thalassemia)、囊性纤维化(cysticfibrosis)、亨廷顿舞蹈病(Huntingtondis-ease)、强直性肌营养不良症(myotonicdystrophy)、脆性X染色体综合征(fragileXsyndrome)在临床周期中排前5名;有耳聋表型的疾病中包括常染色体显性遗传的综合征(Waardenburgsyndrome,Neurofibromatosistype2,TreacherCollinssyndrome,Branchio-oto-renalsyn-drome),常染色体隐性遗传的综合征(Ushersyndrome)以及非综合征遗传性耳聋(详细基因型不详)。由上可见,尽管遗传性耳聋十分是非综合征遗传性耳聋的致畸性在全世界的某些地区和某些社团有争议[3,4],但绝大部分人群希望在明确致病基因的基础上,通过孕期或者产前的方式避免遗传性耳聋疾病的垂直传递,孕育正常听力后代[5,6,7,8]。1.2染色体异常和胚胎植入前遗传学筛查(preimplanta-tiongeneticscreening,PGS)在ESHRE历年颁布的数据中,因染色体构造异常而行PGD的病例数几乎与单基因遗传性疾病并重。染色体异常现象在人类普遍存在,在新生儿中约占0.9%,在孕早期自然流产的人群中,染色体异常因素占50-60%[9]。携带平衡的染色体构造重排的人群,如倒位和罗伯逊易位,这些平衡易位者表型正常,但她们可能面临反复流产、不孕或者后代有先天性畸形和智力减退的高风险。这些问题都可能归结于在减数分裂经过中染色体分离方式,最终导致配子染色体不平衡。一般来讲,易位携带者精子多数为不平衡的,少数为正常的[10]。研究倒位携带者PGD的胚胎中,其染色体分离时,发现不同的分离方式胚胎有很高频率的染色体不平衡,80%的胚胎染色体异常[11]。罗伯逊易位携带者(无论男性或者女性)2/3的胚胎染色体不平衡[12]。固然胚胎有如此高的染色体异常,但是研究发现PGD能够改善携带平衡染色体重排人群的妊娠结果,尤其是反复流产的人[13,14]。1995年,VerlinskyY发表文章[15],以为在辅助生殖经过中,检测胚胎的非整倍性,能够提高妊娠率,从此引入一个新的概念-胚胎植入前遗传学筛查(preimplantationgeneticscreeningPGS)。PGS所采用的技术和PGD大致一样,但其定位是筛查,相对PGD来讲,是属于低危,由于不牵涉某一遗传性疾病在一个家庭中的传递。PGS作为辅助生殖医学领域的一项技术,主要目的是提高妊娠率,适用于高龄,反复辅助生殖经过中移植失败和反复流产。PGS当前仍有争议,之前的报道多为非随机的低水平的研究,当前的随机对照研究显示并不能提高分娩率[16]。原因可能为:1)检测标本的不具有代表性,分裂体有较高嵌合体;2)FISH检测技术的局限性。不同时期的胚胎活检和arrayCGH技术检测23对染色体的非整倍性的策略施行后,可通过辅助生殖分娩率的高低来证明PGS的有效性。1.3人类白细胞抗原配型PGD联合人类白细胞抗原配型是PGD运用于临床的新领域。在一些家庭中,比方淋巴瘤或者-地中海贫血儿童患者后期,需要造血干细胞移植。这些患者在疾病晚期,最好的治疗是进行人类白细胞抗原配型成功的造血干细胞移植,但是临床经过中,供体非常有限。有的父母为给患病晚期的孩子提供适宜的供体,他们会选择再次怀孕,但是这种自然怀孕只要1/4的时机与患儿的白细胞抗原配型成功,这就意味着为拯救疾病晚期的孩子需获得完全配型的造血干细胞,父母亲不得不反复怀孕,通常因胚胎与先证者不配型而终止妊娠。通过PGD-HLA配型后,挑选HLA配型的胚胎进行移植,就能够解决这个问题。当然,PGD-HLA配型本身也有局限性,经白细胞抗原附件的标记连锁分析后与先证者完全配型的胚胎数目会比拟少。在概率上讲,单基因隐性遗传疾病在PGD中得到可移植胚胎(正常和携带)的几率为75%(这是PGD的首要目的),得到与病儿HLA相配胚胎的几率是25%,得到可送并与病儿HLA相配胚胎的几率为75%25%=19%。自2001年YuryVerlinsky[17]报道首例范可尼贫血症PGD-HLA配型成功,PGD已发展到可在一次PGD经过中完成HLA配型鉴定,不但能够得到无此遗传性疾病的胎儿,还能够得到与有此病的兄姐的HLA相配的无病婴儿,在其出生时保存其脐带血(干细胞)用来患病兄姐的治疗。当前PGD-HLA配型已经在-地中海贫血,镰状细胞性贫血,急性淋巴细胞性白血病,骨髓异常增生症,Wiskott-Aldrich综合征(湿疹血小板减少伴免疫缺陷综合征),骨硬化症,X连锁的慢性肉芽肿疾病等疾病中应用。随着遗传性耳聋干细胞治疗研究的深切进入,希望在不久的将来,能通过PGD-HLA应用于遗传性耳聋疾病,不仅能治疗先证者,而且让父母同时拥有一个正常听力儿。1.4有遗传性倾向癌症尽管当前PGD应用于成人迟发性疾病伦理学有争议,但是临床方面一直在探寻求索,自YuryVerlin-sky2001年[18]首例Li-FranmenisyndromePGD成功后,乳腺癌,遗传性乳头状肾癌,视网膜母细胞瘤,家族性腺瘤性息肉病等有遗传倾向的肿瘤疾病已经采用PGD的方式方法来避免在家庭中的垂直传递。1.5线粒体疾病PGD是某些线粒体疾病避免在家庭中传递最好的选择,由于mtDNA遵循严密的母系遗传方式,决定突变垂直传代的类型,即由母亲传给男女后代,而且女儿会继续传给下代,类似于孟德尔的常显及伴性(X)连锁类型。华而不实比拟典型的是线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作(MitochondrialEncephalomyopa-thy,LacticAcidosisandStroke-likeEpisodes,MELAS):近80%病例为A3243G(线粒体编码亮氨酸tRNA)突变,在ESHRE2020年颁布的数据中,曾在2018年做2个周期的此病[2]。线粒体遗传性耳聋中,m1555AG和m1494CT突变可因氨基糖甙类药物诱导感音神经性耳聋。一旦发病当前尚无有效药物治疗,发现有此基因突变的患者终身禁用氨基糖甙类药物。高危家庭中为避免患有线粒体疾病的婴儿出生最佳途径是检查囊胚细胞,评估线粒体突变的几率,将患病几率最小的胚胎进行移植,这是传统的PGD途径。英国议会下院于2021年2月5日投票通过一项历史性的法案,同意英国研究人员继续开展通过医学方式方法防止线粒体遗传性疾病垂直传递的研究。亦称为线粒体DNA替代疗法。即采用辅助生殖的方式方法,将来自携带缺陷线粒体卵细胞的细胞核转移到健康线粒体的捐献者卵子内,由此构成的胚胎将拥有父母亲的细胞核的DNA和卵子捐献者的线粒体DNA。由于引入的线粒体基因只占婴儿总基因的0.1%,可能不会影响婴儿的相貌等其他特征。这是PGD技术新的延伸。当前该技术还需上议院获批。固然英国的伦理及科学审查及民意征询均支持该技术在人类开展实验性应用,但美国相关部门还在考虑能否使用该技术。2活检材料2.1传统活检材料PGD经过需要DNA进行遗传学检测,当前主要有3种途径获得DNA:1)卵子第一极体和第二极体活检,获取第一极体或者第二极体;2)培养至第3天胚胎卵裂期对卵裂球活检,一般取1-2个卵裂球细胞;3)培养第5天囊胚期对外胚层滋养细胞活检,一般取5-15个外胚层滋养细胞。以上3种方式都有各自的优缺点。2.1.1极体活检女性性成熟后每个月经周期有部分卵母细胞进行减数分裂,排出第一极体后完成第一次减数分裂;排卵后,卵母细胞休止于第二次减数分裂中期,此时的卵母细胞一旦与精子相遇,就排出第二极体,完成第二次减数分裂。极体是单倍体细胞,与卵细胞的染色体核型互相对应。极体的活检已经成功应用于母源性单基因遗传性疾病和染色体疾病,极体是减数分裂的排泄物,能保存胚胎的完好性。有些国家禁止对合子进行活检取材,极体恰好能避免此类伦理冲突。但是极体不能对父源性,卵裂后的异常进行检测,且固定极体需要较高的技术性。2.1.2分裂体期活检分裂体期对分裂球活检,即受精后第3天6-8细胞期吸出1个或者2个细胞。分裂球的DNA来自父母双方。而且在活检后即便在不冷冻的情况下能够继续培养第2天至第5天的囊胚期,这为遗传学检测留有48小时时间。分裂体期活检当前仍在被广泛应用。但是取1个细胞因单一DNA量可能会对诊断造成困扰,十分是嵌合体的存在。而当前有研究以为取2个细胞又会造成活胎率的降低[19]。随着新型配方简化的胚胎培养基的引入,体外培养胚胎的发育率得到极大的提高,胚胎体外培养的时间可延长至体外受精后第5天的囊胚期。囊胚培养技术的出现提供了新的获取DNA样本的途径。囊胚外胚层滋养层细胞最终发育成胚外组织如胎盘等,同时能够代表整个胚胎的遗传学状况,新方式方法利用激光切开囊胚的透明带,获取5-15个左右的外胚层滋养细胞用于遗传学检测。采用外胚层滋养细胞进行PGD的优势总结如下:1)细胞数量优势即DNA优势提高诊断的准确性,因囊胚活检可得到5-15个细胞,与一般只能获取单细胞或者2个细胞的分裂体期活检相比,等位基因的脱扣(alleledropout,ADO)更少,嵌合体导致的误诊率更低。2)提高临床的单胎妊娠率和出生率。某些原因可能会导致从D3培养至D5的一部分可能有缺陷的分裂体的淘汰(尽管此观点当前尚有争议)。而囊胚活检经过中的透明带打孔和人工皱缩囊胚腔等操作对胚胎的发育有利[20]。另外随着玻璃化冻存技术推广,为囊胚活检后遗传性检测提供大量时间,临床医生能够选择在下一自然月经周期排卵后子宫内膜同步化增厚,更合适囊胚的着床。而且囊胚经玻璃化冻存后,不影响移植的妊娠率和出生率,甚至比鲜胚移植结果更好。综上所述,通过囊胚活检,同时选择优势囊胚进行移植,可提高单胎的妊娠率和出生率。尽管囊胚的活检比分裂体更复杂,随着此项技术的普及,已经成为各生殖中心的常规操作。2.2囊胚胚液诊断SPalini2020[21]报道初次通过实时PCR方式方法,发如今玻璃化冷冻经过中收集的囊胚胚液中90%存在基因组DNA。并且通过扩增Y染色体上的TSPY1基因鉴定囊胚的性别,这为携带X-连锁疾病的夫妇鉴定男性胚胎提供可能,而对胚液进行全基因组扩增为更进一步基因检测奠定基础。此途径最大的优势是胚液不牵涉到细胞的丢失,相对分裂体和囊胚活检来讲,是一种无创的活检方式方法。J.Cohen[22]在SPalini同年发表的文章称赞其为无侵袭性活检PGD的开场。尽管如此,当前的研究还需确定下面问题:1)囊胚胚液的DNA能否完全能代表囊胚的DNA;2)胚液DNA能否含有来自从胚胎排出的不正常或者降解细胞的DNA;3)此方式方法能否真的是无创,固然提取胚液的经过无细胞的吸出,但是在操作经过中能否会影响囊胚的发育。等待囊胚胚液的深切进入研究,为需行PGD/PGS家庭带来更安全有效的活检方式。3诊断技术3.1FISHFISH应用于临床约20年,主要检测染色体异常和性别选择。根据不同的情况,选择特定带有荧光标记的探针与相应需检测的染色体结合后在显微镜下观察荧光的信号做出结果的判定。但是FISH技术的局限性,如信号不清楚明晰,分析染色体数目限制等,导致其在PGD/PGS中应用有所限制。3.2单细胞PCR单细胞PCR当前主要用于单基因遗传性疾病诊断。单细胞PCR与普通PCR相比因模板量少,可能面临扩增失败、污染、等位基因脱扣等问题。临床检测中多采用多重巢式荧光PCR的策略:多重是同时使用多个(一般为3个以上)目的基因附近的短串联重复序列(shorttandemrepeat,STR)进行连锁分析以防止等位基因脱扣;采用巢式PCR能够扩增出更多目的产物;第二轮一端引物带荧光,扩增的带荧光的产物可用毛细管电泳分析产物片段大小。此方式方法固然需要大量时间来优化PCR条件,但是由于检测周期短,花费较低,准确性较高,仍在单基因遗传性疾病PGD中广泛使用。3.3新技术应用3.3.1单细胞全基因组扩增(wholegenomeamplifica-tion,WGA)技术因单细胞直接进行PCR只要一次扩增时机,DNA产物量有限,进行检测的位点遭到限制。近年来,WGA技术得到发展,能将单拷贝DNA进行全基因组扩增,为后续的遗传学检测提供足量的DNA。当前常用技术有依靠PCR原理的简并寡核苷酸引物PCR(degenerateoligonucleotideprimedPCR,DOP-PCR),扩增前引物延伸反响(primerextensionpreamplifica-tion,PEP);亦有不依靠PCR原理的基于酶促反响的多重替代扩增(multipledisplacementamplification,MDA)。谢晓亮院士课题组于2020年在(Science〕[23]发表了一种全新的单细胞WGA的方式方法屡次退火环状循环扩增技术(multipleannealingandloopingbasedamplificationcycles,MALBAC),该技术起始模板量降到皮克级,具有基因覆盖度更广,扩增的均匀性提高,等位基因脱扣率大大降低等特点,而且可成功应用于单精子细胞[24],分裂球的非整倍性检测[25]。等待此方式方法在临床进行扩大范围的验证,为单基因遗传性疾病诊断提供更准确的诊断。3.3.2新一代测序技术基因单细胞全基因组扩增技术的进步,使得拥有足够的DNA用于下游的遗传学检测。2005年Roche公司454测序仪的出现,标志着新一代测序技术(nextgenerationsequencingtechnology,NGS)问世。目的区域捕获联合NGS是利用定制的探针与基因组DNA进行杂交或者PCR捕获目的基因组区域,随后采用高通量测序技术进行测序的方式方法。对于明确致病基因的家庭,使用PGD方式方法避免致病基因垂直传递经过中必然要挑选健康胚胎进行移植。传统的PCR需联合STR位点监测等位基因的脱扣,但是对于某些基因假如其上下游没有足够的STR位点或者一些由于种族关系等原因STR位点不是杂合造成此检测方式方法的局限性。然而目的区域捕获能包含目的基因区域和及其上下游高度严密连锁的SNP,即采用SNP第3代遗传标记进行监测,然后进行高通量测序,通过家族的单体型连锁分析,确定胎儿基因型的方式方法来进行健康胚胎的挑选。G.Altarescu等在患CharcotMarieTooth1A(CMT1A)疾病的夫妇挑选胚胎经过中[26],同时采用传统的多重巢式PCR方式方法和SNP微阵列分析,结果提示SNP微阵列分析的结果具有准确、可行、耗时短特点。4PGD在遗传性耳聋中应用4.1遗传性耳聋大概情况及PGD应用耳聋是人类最常见的感觉系统疾病,可分为综合征和非综合征性耳聋,世界上大约有3.6亿患病。根据2006年第二次全国残疾人抽样调查报告,我们国家听力残疾人群有2780万,华而不实0-6岁听障儿童13.9万,每年新生2-3万。遗传因素在神经性耳聋中超过50%。当前已经在非综合征性耳聋中发现80多个相关基因)。GJB2是导致遗传性非综合征型耳聋最常见的基因。对于日益增大的耳聋人群,耳聋的早期诊断和干涉已成为防聋控聋的重中之中。在聋病的三级预防中,我们可通过高危家庭的有创产前诊断以及新生儿听力与基因联合筛查来减少聋儿的出生和早期诊断及干涉听障儿童。但是对于有生育遗传性耳聋的高危人群来讲,假如经历1次以上有创产前诊断后且没有能顺利生育听力正常的后代,PGD是理想而又可行的方式方法。在国际上,欧洲[2](波兰的病例在文献发表时为妊娠状态[27]),以色列[28],沙特阿拉伯[5],中国台湾[29]都有PGD应用于遗传性耳聋的成功案例。中国的科学家已经在耳聋基因研究和临床基因诊断方面获得丰富的成果,随着我们国家辅助生殖技术已与国际接轨,我们有能力将PGD技术成功应用于遗传性耳聋疾病,能使生育遗传性耳聋患儿风险的高危家庭孕育听力正常后代。4.2将PGD应用于中国遗传性耳聋疾病的意义中国人口基数大,每年的都有3万新增聋儿。因聋致哑导致的家庭和社会问题尤为突出,聋人家庭承受宏大痛苦及沉重的经济负担。而且因聋致哑会严重影响我们国家的人口素质,增加我们国家的财政负担。当前通过遗传咨询,耳聋基因产前诊断和新生儿听力联合基因筛查策略来减少耳聋出生缺陷已经获得很大的成效。但是对于明确已经知道致聋基因的家庭,渴望拥有正常听力后代,然而通过传统的产前诊断的方式方法只能判定胎儿的基因型。2018年,Klitzman在美国曾通过调查问卷的形式对220名内科医生针对PGD应用进行了调查:仅7.1%内科医生觉得自个有资质回答病人有关PGD的问题,华而不实仅4.9%的内科医生将PGD技术介绍给病人选择,而且也是针对最熟悉的囊性纤维变性[30]。上述调研结果讲明PGD技术在全世界医生中可能存在认识缺乏。随着更多的遗传性耳聋家族中致聋基因的发现,中国的耳鼻喉科医生需深切进入了解此技术。在确定致病基因及致病突变点的遗传性耳聋家族中,假如家属迫切希望拥有一个健康的听力正常的后代,一旦传统的产前诊断技术(包括绒毛膜和羊水穿刺)不能被接受或者反复的产前诊断确定为致病胎儿已经深深地影响孕妇及家属的心理及生理,PGD技术是理想而能接受的选择。从卫生经济学角度出发,PGD费用要低于人工耳蜗植入,十分是双耳的人工耳蜗植入费,且无需终身维护和无身体终身残疾。从孕妇角度考虑,因当前的辅助生殖技术和遗传学分子诊断技术已特别成熟,挑选健康胚胎植入子宫已完全可能,避免反复流产造成心理,生理伤害和伦理冲突。如成功将PGD技术广泛运用于遗传性耳聋疾病,能阻断大量耳聋基因的垂直传递,进而减少人群耳聋基因突变的携带率。结束语PGD是辅助生殖领域的新技术,通过它能够在基因水平预防单基因遗传性疾病的垂直传递。从心理和伦理上考虑,PGD比有创的绒毛或羊水活检更易于被育龄妇女接受。综述所述,PGD具有广泛的应用前景。但是PGD费用较昂贵,而且花费时间比拟长。在应用于成人迟发性疾病方面当前仍有争议。在PGD技