化学生物絮凝与化学混凝污水处理工艺的微生物种群结构比较

化学生物絮凝与化学混凝污水处理工艺的微生物种群结构比较分析摘要：从化学生物絮凝、化学混凝污水工艺的污泥样品中提取总DNA，进行PCR扩增，结合DGGE（变性浓度梯度凝胶电泳），分析了样品中微生物种群结构，讨论并比较了在两种污水处理工艺中微生物种群结构的不同。结果证明，在化学生物絮凝污水处理工艺中，微生物种群庞大且复杂，并对污染物的处理起到较为重要的作用。关键词：化学生物絮凝；化学混凝；PCR；DGGE；微生物种群结构；Shannon多样性指数ComparisionofCommunitystructureanalysisinchemicalandbiologicalflocculationwithchemicalcoagulationprocessAbstract:Inthispaper,thedifferenceofthecommunitystructurebetweenthechemical-biologicalflocculationandchemicalcoagulationwastewatertreatmentprocesshasbeendiscussedandcompariedwithmolecularbiologicalmethods,suchasDNAextraction,polymerasechainreaction(PCR)anddenaturtinggradientgelelectrophoresis(DGGE).Theresulthasindicatedthathighnumberofbacterialspeciespresentedinthesludgeofthechemical-biologicalflocculationprocesswithcomplexity,whichplayedanimportantroleintheremovalofthepollutant.KeyWords:chemicalandbiologicalflocculation,chemicalcoagulation,PCR,DGGE,activatedsludge,microbialcommunitystructure,ShannonDiversityIndex城市污水化学－生物絮凝强化一级处理是利用化学混凝和生物絮凝联合作用强化沉淀的污水处理工艺，一般由一个停留时间较短（约30min）的曝气池和沉淀池构成。工艺中采用空气混合絮凝反应和污泥回流，利用外加的化学混凝剂和污水中的天然生物絮凝剂，将化学混凝处理与生物絮凝强化处理相结合，充分发挥生物的絮凝吸附作用以及化学混凝对颗粒状和胶体状物质的去除作用，试验中应用PCR－DGGE技术对化学生物絮凝工艺及化学混凝反应器中微生物种群进行了初步的比较分析。1.试验材料和方法1.1样品的采集及预处理：污泥样品取自上海安亭污水处理厂国家“863”计划课题污水处理中试装置（以下称化学生物絮凝处理工艺及化学混凝处理工艺）（见图1），化学生物絮凝处理工艺中曝气池采用微孔曝气管曝气，分三段推流回转式布置，阶梯式速度梯度变化，每段可独自调节曝气量以改变速度梯度。化学混凝采用机械搅拌，分三格推流式布置。两反应器中加药量为：PAFC70mg·L-1。取样条件以及运行参数见表1。图1化学生物絮凝、化学混凝处理工艺中试装置图（50t·d-1）Fig1Thepilotplant(50t/d)inShanghaiAntingwastewatertreatmentplant表1取样位置和条件Table1Thepositionsandprocessconditionsforsampling取样装置进水化学生物絮凝污水水处理中试装装置化学混凝污水处理理中试装置取样位置------化学生物絮凝反应应池一、二、三三廊道化学混凝反应池一一、二、三格格样品名称Sample1Sample2,3,,4Sample5,6,,7运行情况DO(mg·L--1)------一、二、三廊道分分别为3.7、3.1、1.7-------pH------6.9～7.36.8～7.533絮凝剂------投加聚合硫酸铝铁铁70mgg·L-1COD(mg·LL-1)174.6264.8688.74NH3-N(mgg·L-1)14.5410.5411.62TP(mg·LL-1)3.410.931.6样品预处理过程见图2，化学混凝池样品取泥水混合物1000ml，其余步骤同进水。图2样品预处理过程Fig.2Thepre-treatmentofthesample1.2DNA提取：方法及试剂见文献3-6。提取到的总DNA用0.5％的琼脂糖凝胶电泳（琼脂糖1g，0.5×TBE缓冲液100mL,电泳缓冲液为0.5×TBEbuffer）进行检测，在紫外灯下观察拍照。电泳所用Marker为宝生物工程（大连）有限公司生产的λ-HindⅢdigest。1.3PCR引物及程序、PCR产物浓缩：见表2，PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，在紫外灯下观察拍照。电泳所用Marker为宝生物工程（大连）有限公司生产的DNAMarkerDL2000。表2试验中所用PCR引物及条件Table1PCRprimersandconditionsusedinthisstudyPCR引物P15`-ATTAACCGCGGGCTGCCTGG-33`P25`-CCGCCCGGCCGCGGCGCGGGCGGGCCGGGGCCGGGGGGCACGGGGGGGCCCCCATACGGGGAGGGCAGCAAG-3`PCR扩增程序94℃预变性2mmin94℃，45s裂裂解共30cycless72℃延伸100min60℃，45s退退火72℃，90s延延伸PCR反应体系无菌ddH2O399μL，10×PCCRbufffer55μL，2.5mmmol·L-1dNTP溶液1μL，10mmmol·L-1引物P1、P2各1μL，Taq酶1U，样品DNA溶液2μL合并6管PCR产物，用Parafilm膜封口，-70℃冷冻过夜，取出后用冷冻干燥机抽干4小时，将得到的干粉溶解于30μLddH2O中,-20℃保存。1.4DGGE条件：PCR产物进一步用DGGE（变性梯度凝胶电泳）分离，仪器为DcodeTMSystem(bio-RadLaboratories)。凝胶变性梯度30%～60%，聚丙烯酰胺浓度8%，厚1mm，电泳缓冲液为0.5×TAE，电压150V，60℃，电泳时间4h。在含溴乙锭（0.5mg·L-1）0.5×TAE缓冲液中染色后，在紫外灯下观察拍照。1.5生物多样性分析分析出DGGE图谱的密度曲线后（SmartView软件），利用Shannon多样性指数计算样品的生物多样性，Shannon多样性指数计算公式如下：其中：H-Shannon多样性指数；ni-第i个条带的峰高值；N-密度曲线中所有峰高之和。1.6污泥样品显微镜观察取污泥样品，在Leica显微镜下观察并拍照。2结果与讨论2.1污泥样品总DNA提取结果从样品中提取的总DNA通过0.5％的琼脂糖凝胶电泳检验，通过SmartView软件分析提取出的DNA片段大小约为23kb，样品浓度计算结果列于表2。表2样品DNA浓度Table2TheconcentrationofextractedDNA样品1234567DNA浓度(ugg·L-1)0.1222832410269.68.77.5从表2可以看出化学生物絮凝反应体系中DNA含量（样品2，3，4）约为化学混凝池体系中（样品5，6，7）的20-100倍左右，这说明在前者的反应体系中存在含量较高的微生物；另外从表1可以看出，在投加相同剂量的絮凝剂时，化学生物絮凝工艺对污水当中污染物的去除表现出更高的去除率，由此可以初步判断，在化学生物絮凝工艺中，微生物的存在及其作用是比较明显的，但微生物对污染物的去除途径究竟是以生物降解还是生物吸附为主则有待于更深入的研究。2.2PCR扩增结果取2μLDNA样品作为模板，进行PCR扩增，产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检验，经SmartView软件分析，扩增得到的DNA片段大小为220bp左右，为要扩增的目的片段。2.316SrRNA基因片段PCR扩增的DGGE结果图3是经分离的16SrRNA的DGGE图谱，图中亮度明显的条带较少，同时也由于存在较多的亮度比较暗的条带，导致图谱中条带有一定的模糊，这可能是由于在活性污泥样品中，存在着数量庞大的细菌种类。图3扩增后样品DGGEFig.316SrDNAseparatedbyDGGEDGGE图谱中条带的数目和亮度并不能完全准确地反映微生物群落中种的数量和丰富程度。由于rRNA操纵子的多样性、异相性，使得一种微生物可能会产生多个DGGE条带[8-10]。另一方面，部分的16srDNA序列并非总是能做到“种”（species）之间的区分，使得一个DGGE条带可能会代表几种具有相同部分的16srDNA序列的种[11]。此外，在模板DNA中，由于浓度的不同，使得数量少的序列扩增不充分，在DGGE胶片中无法看到相应的条带，因此DGGE图谱中仅仅反映了样品中数量最丰富的DNA类型。由于16srDNADGGE存在的诸多缺陷，由扩增16srDNA序列得到的DGGE条带图谱而计算的生物多样性仅仅能作为一种指示，而不能作为衡量生物多样性的一个绝对指标[12]。参照进水样品，可将图3中条带代表的菌种大致分为三类（见表2）。表2样品菌种分类Table2ThecategoryofthebacteriaintheDGGEprofile菌种种类典型条带化学生物絮凝池化学混凝池与进水样品比较，细细菌数量增加加的Bandb,cc,f,h,,i,j,kkBandc,ff,g与进水样品比较，细细菌数量变化化不大的Banda,ee,gBande与进水样品比较，细细菌数量减少少的BanddBanda,bb,d,i,,k在化学生物絮凝池中，与进水样品比较，细菌数量增加的微生物种类较多，一方面这是因为反应器中30%的污泥回流量增加了微生物量，另一方面也说明这些细菌能够很好地适应环境的变化，甚至可能还在进行细菌的繁殖。比较样品1、5、6、7的DGGE图，可以看出，化学混凝池内的细菌种类基本与进水相一致，这也符合在化学混凝池内没有曝气供氧、没有污泥回流，其内微生物主要来自进水的原则，也符合在化学混凝池内，污染物如COD、SS、TP的去除，主要来自化学药剂引起的絮凝作用，而与微生物作用无关。2.4样品多样性指数分析根据Shannon多样性指数公式进行计算，结果列于表3中。表3Shannon多样性指数计算结果Table3TheShannonDiversityIndex样品1234567H1.821.701.671.641.731.711.70Shannon多样性指数H通常用于评价一个微生物种群内物种的丰富性，H值越高，微生物种群越丰富。多样性指数通常由两个因素构成：①样品中物种的数量或称为种的丰富度，②各个物种的量的分布或称为种的均匀度。由表3可以看出，进水样品（样品1）H值最高，这是由于样品1中（见图3）条带数目较多而且优势菌种较少的结果。进水样品中微生物种群最为丰富，各种群数量分布比较均匀，数量明显占优势的菌种较少，在环境发生改变（氧气、添加PAFC等）的情况下，进水中一些微生物由于不能适应而遭到淘汰，存活在反应器中的菌种则能够很好地适应反应器的条件。2.5显微镜观察结果图4是对污泥样品进行镜检的结果（2000倍）。化学混凝池的污泥样品，絮体松散，颜色呈暗灰，是典型的化学污泥状态；在化学生物絮凝池第二廊道的污泥样品中，观察到有钟虫的存在，菌胶团呈活性污泥的黄褐色，这更进一步说明在化学生物絮凝池中微生物作用的存在。图4-a样品3显显微镜观察结结果图4-b样品6显显微镜观察结结果Fig.4-aTThemiicrogrraphoofsammple33Fig.4-aTThemiicrogrraphoofsammple663结论在化学生物絮凝反应器中，微生物多样性相当丰富（表3），微生物种群结构也比较复杂。在化学混凝反应器中，微生物种类同样较为丰富，但数量与化学生物絮凝反应器比较则极少（表2）。结合表1的数据可以看出，化学生物絮凝池内由于生物作用的存在，使得其对污染物的去除率显著高于化学混凝池。对于化学生物絮凝池，进水中的微生物根据其在反应器中浓度的变化大致可以划分为三类：增加、维持不变和减少。图3中Bindb、c、i、j等条带所代表的菌种，属于优势菌种，很有可能是反应器中生物作用的主体。对两套反应器内污泥样品的显微镜观察结果同样表明，在曝气且有污泥回流的化学生物絮凝池内，微生物生长状态较好，明显不同于化学污泥，有较好的生物作用存在。由于污泥样品成分复杂，样品中的痕量重金属，盐类，均有可能在样品的DNA提取，PCR扩增，DGGE分离过程中产生复杂的影响，使得利用PCR－DGGE分子生物学技术对污泥样品的微生物分析存在一定的困难，本文只是进行了该技术在污水处理样品中的初步研究，相信随着研究的深入，结合常规的微生物培养分离、微生物镜检等技术，对环境微生物进行研究将会有较好的发展前景。参考文献[1]吴志平，夏四清，扬殿海，高廷耀.化学生物絮凝工艺处理城市污水比较研究.重庆环境科学，2003，25(7)：12–14[2]张智，邱维，张国庆.城市污水强化一级处理技术及发展趋势.重庆环境科学，2001，23(1)：46–49[3]萨姆布鲁克J，弗里奇EF曼尼阿蒂斯T（金冬雁等译）.分子克隆试验指南.第二版.北京：科学出版社，1996.919–929[4]陈灏，唐小树，林洁等.不经培养的农田土壤微生物种群构成及系统分类的初步研究.微生物学报，2002，42(4)：478–483[5]YL

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